Murine Korte As Ventriculaire Hartschijven voor Elektrofysiologische Studies
Summary
Hier beschrijven we de voorbereiding van levensvatbare ventriculaire plakjes van volwassen muizen en hun gebruik voor scherpe elektrodeactiepotentiële opnamen. Deze multicellulaire preparaten leveren een geconserveerde in vivo weefselstructuur, waardoor ze in vitro een waardevol model vormen voor elektrofysiologische en farmacologische studies.
Abstract
Murine cardiomyocyten zijn uitgebreid gebruikt voor in vitro studies van hartfysiologie en nieuwe therapeutische strategieën. Echter, multicellulaire preparaten van gedissocieerde cardiomyocyten zijn niet representatief voor de complexe in vivo structuur van cardiomyocyten, niet-myocyten en extracellulaire matrix, die zowel mechanische als elektrofysiologische eigenschappen van het hart beïnvloedt. Hier beschrijven we een techniek om levensvatbare ventriculaire plakjes volwassen muisharten te bereiden met een behoud van in vivo weefselstructuur en hun geschiktheid voor elektrofysiologische opnamen aan te tonen. Na afscheiding van het hart worden ventrikels gescheiden van de atria, geperfumeerd met Ca2 + -vrije oplossing die 2,3-butaandionmonoxime bevat en ingebed in een 4% laagsmelt agarose blok. Het blok is op een microtome geplaatst met een trillend mes en weefselschijfjes met een dikte van 150-400 μm zijn bereid om de vibratie vrij te houdenFrequentie van het mes bij 60-70 Hz en beweeg het mes zo langzaam mogelijk naar voren. De dikte van de plakjes hangt af van de verdere toepassing. Plakjes worden opgeslagen in ijskoude Tyrode's oplossing met 0,9 mM Ca 2+ en 2,3-butandiolmonoxime (BDM) gedurende 30 minuten. Daarna worden plakken over 30 minuten overgebracht naar 37 ° C DMEM om de BDM uit te spoelen. Plakjes kunnen worden gebruikt voor elektrofysiologische studies met scherpe elektroden of micro-elektrode arrays, voor krachtsmetingen om contractiele functie te analyseren of om de interactie van getransplanteerde stamcel-afgeleide cardiomyocyten en gastheerweefsel te onderzoeken. Voor scherpe elektrode opnames wordt een plak in een 3 cm celcultuurschotel geplaatst op de verwarmingsplaat van een omgekeerde microscoop. De plak wordt gestimuleerd met een unipolaire elektrode, en intracellulaire actiepotenties van cardiomyocyten in de plak worden opgenomen met een scherpe glaselektrode.
Introduction
Weefselschijfjes zijn vaak gebruikt in de basiswetenschap, aangezien Yamamot en Mcllwain in 1966 toonden dat de elektrische activiteit van hersenschijfjes in vitro 1 wordt behouden. Sindsdien zijn elektrofysiologische en farmacologische studies uitgevoerd op plakjes van hersenen 2 , lever 3 , long 4 en myocardiaal weefsel 5 , 6 , 7 . Eerste patch-clamp opnames in ventriculaire plakjes van neonatale rat harten werden beschreven in 1990 8 , maar deze techniek viel al een tijdje in vergetelheid. Meer dan een decennium later vestigde onze groep een nieuwe methode om muizen embryonale 9 , neonatale 10 en volwassen 11 hartschijven te bereiden. Deze levensvatbare weefselplakken kunnen worden gebruikt voor acute experimenten (volwassen plakS kunnen meerdere uren worden gekweekt) of korte-termijncultuur experimenten (embryonale en neonatale plakjes kunnen enkele dagen worden gekweekt). Plakjes tonen in vivo zoals elektrofysiologische kenmerken en een homogene excitatieverspreiding zoals beoordeeld door scherp elektrode-actiepotentieel en micro-elektrode-opnamen 11 . Door hun "tweedimensionale" morfologie bieden ze rechtstreekse toegang tot opnameelektroden aan alle gebieden van de ventrikel, waardoor ze een interessant instrument zijn voor elektrofysiologische onderzoeken en nieuwe experimentele opties opbouwen in vergelijking met Langendorff-perfuse gehele harten. Drugrespons van de plakjes naar ionenkanaalblokkers zoals verapamil (L-type Ca 2+ -kanaalblokker), lidocaïne (Na + -kanaalblokker), 4-aminopyridine (niet-selectieve spanningsafhankelijke K + -kanaalblokker) en linopirdine (KCNQ K + -kanaalblokkeraar) 9 , 11 </suP> correspondeerde met bekende effecten op gedissocieerde cardiomyocyten. Isometrische krachtmetingen onthulden een positieve krachtfrequentieverhouding en stelden sterk intacte contractiele functie 10 voor . Deze bevindingen aangetoond dat murine ventriculaire plakjes geschikt zijn als een in vitro weefselmodel voor fysiologische en farmacologische studies. Bovendien zijn ventriculaire snijpunten van ontvanger harten in combinatie met scherpe elektrode opnames een zeer behulpzaam hulpmiddel om elektrische en mechanische integratie te identificeren, evenals rijping van transplantaat van 12 , 13 , 14 en stamcellen afgeleide 15 cardiomyocyten.
Samenvattend zijn ventriculaire plakjes een waardevol en goed vast te stellen multicellulair weefselmodel en moeten beschouwd worden als complementair aan gedissocieerde cardiomyocyten en Langendorff-geperfuseerde hartenIn het hart- en vaatonderzoek, met het grootste voordeel van het leveren van een in vivo- weefselstructuur (in tegenstelling tot dissociatiecellen), evenals de directe toegang van meettechnologieën zoals scherpe elektrodeopnamen naar alle hartstreken (in tegenstelling tot hartpreparaten).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ventriculaire plakjes maken elektrofysiologische, farmacologische en mechanische studies mogelijk met een behouden in vivo weefselstructuur en directe toegang van de meettechnologie naar alle regio's van het hart. Fysiologische actiepotentieel eigenschappen zijn aangetoond in embryonale, neonatale en volwassen plakjes 9 , 10 , 11 . De vitaliteit van de plakjes, behalve de oppervlaktelagen die direct beschadigd zijn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen de ondersteuning die wordt verstrekt door de workshops en de dierfaciliteit van het Institute of Neurophysiology. Dit werk werd ondersteund door Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune en Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
Referências
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts–a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
