Murine Kurze Axis Ventrikuläre Herzscheiben für elektrophysiologische Studien

Summary

Hier beschreiben wir die Herstellung von lebensfähigen ventrikulären Scheiben von erwachsenen Mäusen und deren Verwendung für scharfe Elektroden-Aktionspotentialaufnahmen. Diese multizellulären Präparate bieten eine konservierte de vivoähnliche Gewebestruktur, die sie zu einem wertvollen Modell für elektrophysiologische und pharmakologische Studien in vitro macht .

Abstract

Murine Kardiomyozyten wurden weitgehend für In-vitro- Studien der Herzphysiologie und neue therapeutische Strategien verwendet. Allerdings sind multizelluläre Präparate von dissoziierten Kardiomyozyten nicht repräsentativ für die komplexe in vivo- Struktur von Kardiomyozyten, Nicht-Myozyten und extrazellulärer Matrix, die sowohl mechanische als auch elektrophysiologische Eigenschaften des Herzens beeinflusst. Hier beschreiben wir eine Technik zur Vorbereitung lebensfähiger ventrikulärer Scheiben von erwachsenen Mausherzen mit einer konservierten de vivoähnlichen Gewebestruktur und zeigen ihre Eignung für elektrophysiologische Aufnahmen. Nach der Exzision des Herzens werden Ventrikel von den Vorhöfen abgetrennt, mit einer Ca ²⁺ -freien Lösung, die 2,3-Butandionmonoxim enthält, perfundiert und in einen 4% niederschmelzenden Agaroseblock eingebettet. Der Block wird auf ein Mikrotom mit einer Vibrationsklinge gelegt und Gewebeschnitte mit einer Dicke von 150-400 μm werden vorbereitet, wobei die Vibration frei bleibtQuency der Klinge bei 60-70 Hz und bewegt die Klinge so langsam wie möglich nach vorne. Die Dicke der Scheiben hängt von der weiteren Anwendung ab. Die Scheiben werden in eiskalter Tyrode-Lösung mit 0,9 mM Ca ²⁺ und 2,3-Butandionmonoxim (BDM) für 30 min gelagert. Danach werden die Scheiben für 30 min auf 37 ° C DMEM übertragen, um das BDM zu waschen. Scheiben können für elektrophysiologische Untersuchungen mit scharfen Elektroden oder Mikroelektroden-Arrays verwendet werden, um Kraftmessungen zu analysieren, um die kontraktile Funktion zu analysieren oder die Wechselwirkung von transplantierten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten und Wirtsgewebe zu untersuchen. Für scharfe Elektrodenaufnahmen wird eine Scheibe in eine 3 cm Zellkulturschale auf der Heizplatte eines invertierten Mikroskops gegeben. Die Scheibe wird mit einer unipolaren Elektrode stimuliert und intrazelluläre Aktionspotentiale von Kardiomyozyten innerhalb der Scheibe werden mit einer scharfen Glaselektrode aufgezeichnet.

Introduction

Dünngewebescheiben wurden in der Grundwissenschaft häufig verwendet, da Yamamot und Mcllwain 1966 zeigten, dass die elektrische Aktivität von Hirnschnitten in vitro ¹ aufrechterhalten wird . Seither wurden elektrophysiologische und pharmakologische Studien an Scheiben aus Gehirn ² , Leber ³ , Lunge ⁴ und Myokardgewebe ^{5 , 6 , 7} durchgeführt. Erste Patch-Clamp-Aufnahmen in ventrikulären Scheiben aus neonatalen Rattenherzen wurden im Jahre 1990 beschrieben ⁸ , aber diese Technik fiel für einige Zeit in Vergessenheit. Mehr als ein Jahrzehnt später, unsere Gruppe eine neue Methode zur Vorbereitung murine embryonalen ⁹ , neonatale ¹⁰ und erwachsenen ¹¹ Herz-Scheiben. Diese lebensfähigen Gewebeschnitte können für akute Experimente (erwachsene Scheibe) verwendet werdenS kann für mehrere Stunden kultiviert werden) oder kurzfristige Kulturversuche (embryonale und neonatale Scheiben können für einige Tage kultiviert werden). Die Scheiben zeigen in vivo wie elektrophysiologische Eigenschaften und eine homogene Anregungsspanne, wie sie durch scharfe Elektrodenwirkungspotentiale und Mikroelektrodenanordnungen aufgezeichnet wird ¹¹ . Aufgrund ihrer "zweidimensionalen" Morphologie erlauben sie den direkten Zugang von Aufzeichnungselektroden zu allen Bereichen des Ventrikels, was sie zu einem interessanten Werkzeug für elektrophysiologische Untersuchungen macht und im Vergleich zu Langendorff-perfundierten Herzen ganz neue experimentelle Möglichkeiten aufwirft. Arzneimittelreaktion der Scheiben auf Ionenkanalblocker wie Verapamil (L-Typ Ca ²⁺ -Kanalblocker), Lidocain (Na ⁺ -Kanalblocker), 4-Aminopyridin (unselektivspannungsabhängiger K ⁺ -Kanalblocker) und Linopirdin (KCNQ K ⁺ -Kanal-Blocker) ^{9 , 11} </suP> entsprach den bekannten Wirkungen auf dissoziierten Kardiomyozyten. Isometrische Kraftmessungen zeigten eine positive Kraftfrequenzbeziehung und drängten eine intakte kontraktile Funktion ¹⁰ . Diese Ergebnisse zeigten, dass murine ventrikuläre Scheiben als in vitro Gewebemodell für physiologische und pharmakologische Studien geeignet sind. Darüber hinaus haben sich die ventrikulären Scheiben der Empfängerherzen in Kombination mit scharfen Elektrodenaufnahmen als sehr hilfreiches Werkzeug erwiesen, um die elektrische und mechanische Integration sowie die Reifung der transplantierten fetalen ^{12 , 13 , 14} und der Stammzellen-abgeleiteten ¹⁵ Kardiomyozyten zu charakterisieren.

Zusammenfassend sind ventrikuläre Scheiben ein wertvolles und gut etabliertes multizellulares Gewebemodell und sollten als komplementär zu dissoziierten Kardiomyozyten und Langendorff-perfundierten Herzen betrachtet werdenIn der Herz-Kreislauf-Forschung mit dem großen Vorteil der Bereitstellung einer de vivoähnlichen Gewebestruktur (im Gegensatz zu dissoziierten Zellen) sowie direkten Zugang von Messtechniken wie scharfe Elektrodenaufnahmen zu allen Regionen des Herzens (im Gegensatz zu ganzen Herzpräparaten).

Protocol

Die Tierhaltung muss den Richtlinien des örtlichen Tierschutzausschusses und der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments entsprechen. 1. Lösungen vorbereiten Die Lösung von Tyrode ohne Ca 2+ (Zusammensetzung in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, Glucose 10, HEPES 5, 2,3-Butandionmonoxim (BDM) 30. pH-Wert auf 7,4 einstellen Mit NaOH bei 4 ° C. Die Lösung von Tyrode mit Ca 2+ (Zusammen…

Representative Results

Myokardinfarkt führt zu einem nahezu irreversiblen Verlust von Kardiomyozyten. Zell-Ersatz-Therapie mit Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten für exogene Herzregeneration ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz. Die elektrische Integration und Reifung der transplantierten Zellen ist entscheidend für die Sicherheit und Effizienz der Zellersatztherapie. Zur Beurteilung der Integration und Reifung wurden die von in…

Discussion

Ventrikuläre Scheiben ermöglichen elektrophysiologische, pharmakologische und mechanische Untersuchungen mit einer konservierten de vivoähnlichen Gewebestruktur und einem direkten Zugang der Messtechnik zu allen Regionen des Herzens. Physiologische Wirkungspotentialeigenschaften wurden in embryonalen, neonatalen und erwachsenen Scheiben ^{9 , 10 , 11} nachgewiesen. Die Vitalität der Scheiben, mit Ausnahme der Oberflä…

Materials

Leica VT 1000s	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		Microtome with vibrating blade.
Stainless Steel Blades	Campden Instruments, Loughborough, England	7550-1-SS
Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	Z627992
Fine brush, e.g. size 6 (4/32")	VWR, International, Radnor, USA	149-2125
Preparation table			self made
Molt for embedding ventricles in agarose			self made
1 ml Syringe	Becton, Dickinson;  Franklin Lakes, USA	300013
27Gx3/4“ Needles	Braun, Melsungen, Germany	4657705
20G 11/2“ Needles		4657519
Small scissor	WPI, Sarasota, USA	501263
Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip	WPI, Sarasota, USA	500342
Oxygen gas (medical grade O2)	Linde, Munich, Germany
Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2)	Linde, Munich, Germany
NaCL	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	7647-14-5
KCL	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746436
CaCl2	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746495
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	NIST200B
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	51558
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S5761
D(+)-Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	G8270
MgSO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	M7506
NaOH	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S8045
Cyanoacrylate glue	Henkel, Düsseldorf, Germany
Low-melt Agarose	Roth, Karlsruhe, Germany	6351.2
Heparin-sodium-25000 I.E./5mL	Ratiopharm, Ulm, Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM), high glucose, GlutaMAX	ThermoScientific, Waltham, USA	10566016
SEC-10LX Amplifier	npi electronic GmbH, Tamm, Germany	SEC-10LX
EPC 9	HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany
Zeiss Axiovert 200	Zeiss, Oberkochen, Germany
Low magnification Micromanipulator	Narashige, Tokyo, Japan	Nm-3
High magnification, three-axis micromanipulator	Narashige, Tokyo, Japan	MHW-3
Peristaltic perfusion pump	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	PPS2
2-channel temperature controller	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	TCO02
Square pulse stimulator	Natus Europe GmbH, Planegg, Germany	Grass SD9
Glass capillaries	WPI, Sarasota, USA	1B150F-1