Мышцы с короткими осями для желудочковых сердец для электрофизиологических исследований
Summary
Здесь мы описываем подготовку жизнеспособных сегментов желудочков у взрослых мышей и их использование для записи о потенциальных потенциальных возможностях электродов. Эти многоклеточные препараты обеспечивают сохраненную in vivo структуру ткани, что делает их ценной моделью для электрофизиологических и фармакологических исследований in vitro .
Abstract
Мышечные кардиомиоциты широко используются для исследований физиологии сердца и новых терапевтических стратегий in vitro . Однако многоклеточные препараты диссоциированных кардиомиоцитов не являются репрезентативными для комплексной in vivo структуры кардиомиоцитов, немиоцитов и внеклеточного матрикса, что влияет как на механические, так и на электрофизиологические свойства сердца. Здесь мы описываем методику подготовки жизнеспособных желудочковых срезов взрослых мышечных сердец с сохраненной структурой, подобной ткани in vivo , и демонстрируем их пригодность для электрофизиологических записей. После удаления сердца желудочки отделяются от предсердий, перфузируются бескислотным раствором Ca 2+, содержащим 2,3-бутанионный моноксим, и внедряют в 4% низкоплавкий агарозный блок. Блок размещен на микротоме с вибрирующим лезвием, а кусочки ткани толщиной 150-400 мкм подготовлены, сохраняя частоту вибрацииЧастота лезвия на 60-70 Гц и перемещение лезвия вперед как можно медленнее. Толщина срезов зависит от дальнейшего применения. Ломтики хранятся в ледяном растворе Tyrode с 0,9 мМ Ca 2+ и 2,3-бутандионмоноксимом (BDM) в течение 30 мин. Затем срезы переносят в DMEM на 37 ° C в течение 30 минут для промывки BDM. Ломтики могут использоваться для электрофизиологических исследований с острыми электродами или микроэлектронными массивами, для измерения силы для анализа сократительной функции или для исследования взаимодействия трансформированных стволовых клеток-кардиомиоцитов и ткани хозяина. Для резких записей электродов срез помещают в чашку для культивирования клеток размером 3 см на нагревательной пластине перевернутого микроскопа. Лоскут стимулируется однополярным электродом, а потенциал внутриклеточного действия кардиомиоцитов внутри среза регистрируется острым стеклянным электродом.
Introduction
Тонкие срезы ткани часто использовались в фундаментальной науке, так как в 1966 году Ямамот и Маклвейн показали, что электрическая активность срезов мозга поддерживается in vitro 1 . С тех пор электрофизиологические и фармакологические исследования проводились на срезах из мозга 2 , печени 3 , легкого 4 и ткани миокарда 5 , 6 , 7 . Первые записи патч-зажима в желудочковых срезах из сердец новорожденных крыс были описаны в 1990 году 8 , но эта техника в течение некоторого времени зашла в небытие. Спустя более десятилетия наша группа разработала новый метод подготовки мышиных эмбриональных 9 , неонатальных 10 и взрослых 11 срезов сердца. Эти жизнеспособные срезы ткани могут использоваться для острых экспериментов (взрослый срезS можно культивировать в течение нескольких часов) или краткосрочные эксперименты с культурой (зародыши и новорожденные срезы можно культивировать в течение нескольких дней). Ломтики демонстрируют in vivo, как электрофизиологические характеристики, и гомогенный разброс возбуждения, оцениваемый с помощью резкого потенциала действия электрода и записей микроэлектродов. Благодаря своей «двумерной» морфологии они позволяют осуществлять прямой доступ к регистрирующим электродам во все области желудочка, что делает их интересным инструментом для электрофизиологических исследований и создает новые экспериментальные варианты по сравнению с перентованными сердцами Лангендорфа. Реакция лекарственного средства срезов на блокаторы ионных каналов, такие как верапамил (L-тип Ca 2+ -канальный блокатор), лидокаин (блокатор Na + -канала), 4-аминопиридин (неселективный зависимый от напряжения K + -канальный блокатор) и линопирдин (KCNQ K + -канальный блокатор) 9 , 11 </suP> соответствует известным эффектам на диссоциированных кардиомиоцитах. Измерения изометрической силы выявили положительную частотную зависимость силы и сильно предложили неповрежденную сократительную функцию 10 . Эти данные показали, что мышиные желудочковые срезы пригодны в качестве модели ткани in vitro для физиологических и фармакологических исследований. Кроме того, желудочковые срезы сердечников-реципиентов в сочетании с резкой записью электродов оказались очень полезным инструментом для характеристики электрической и механической интеграции, а также созревания трансплантированных эмбриональных карциномиоцитов 12 , 13 , 14 и стволовых клеток.
Таким образом, желудочковые срезы представляют собой ценную и хорошо устанавливаемую многоклеточную модель ткани и должны считаться комплементарными диссоциированным кардиомиоцитам и сердечно-перфузионным сердцам ЛангендорфаВ кардиоваскулярных исследованиях, с основным преимуществом обеспечения структуры in vivo как ткани (в отличие от диссоциированных клеток), а также прямого доступа к измерительным технологиям, таким как резкие записи электродов во все области сердца (в отличие от цельных препаратов сердца).
Protocol
Representative Results
Discussion
Желудочковые срезы позволяют проводить электрофизиологические, фармакологические и механические исследования с сохраненной структурой ткани, подобной ткани in vivo , и прямым доступом к измерительной технологии во все области сердца. Свойства потенциала физиологического действи?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем поддержку, оказываемую семинарами и животным учреждением Института нейрофизиологии. Эта работа была поддержана Уолтером и Маргой Болл-Стифтунгом, Кёльном Форчунтом и Немецкой школой для Герцфоршунга.
Materials
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
Referências
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts–a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
