Fette di cuore ventricolare dell'asse corto dell'urina per gli studi elettrofisiologici
Summary
Qui descriviamo la preparazione di fette ventricolari vitali da topi adulti e il loro utilizzo per registrazioni potenziali di azione elettrodo. Queste preparazioni multicellulari forniscono una struttura tissutale conservata in vivo , che li rende un prezioso modello per studi elettrofisiologici e farmacologici in vitro .
Abstract
Cardiomiociti murini sono stati ampiamente utilizzati per studi in vitro di fisiologia cardiaca e nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, le preparazioni multicellulari di cardiomiociti dissociati non rappresentano la struttura complessa in vivo di cardiomiociti, non miociti e matrice extracellulare, che influenza sia le proprietà meccaniche che elettrofisiologiche del cuore. Qui descriviamo una tecnica per preparare fette ventricolari vitali di cuori adulti con un tessuto tissutale in vivo e dimostrare la loro idoneità alle registrazioni elettrofisiologiche. Dopo l'escissione del cuore, i ventricoli vengono separati dall'atria, perfezionati con soluzione Ca 2+ -libera contenente 2,3-butanedione monoxime e incorporati in un blocco agarosio a basso contenuto di fusione al 4%. Il blocco è posto su un microtomo con una lama vibrante, e fettine di tessuto con uno spessore di 150-400 μm sono preparate mantenendo la vibrazione freDella lama a 60-70 Hz e spostare la lama in avanti in modo più lento possibile. La spessore delle fette dipende dall'ulteriore applicazione. Le fette vengono conservate in soluzione di Tyrode ghiacciata con 0,9 mM Ca 2+ e 2,3-butanedione monoxime (BDM) per 30 minuti. Successivamente, le fette vengono trasferite a 37 ° C di DMEM per 30 minuti per lavare il BDM. Le fette possono essere utilizzate per studi elettrofisiologici con elettrodi taglienti o matrici di microelettrodi, per misurare le forze per analizzare la funzione contrattile o per indagare l'interazione tra i cardiomiociti derivanti dalle cellule staminali trapiantati e il tessuto ospite. Per registrazioni di elettrodo nitide, una fetta viene posta in un piatto di coltura da 3 cm sulla piastra riscaldante di un microscopio invertito. La fetta è stimolata con un elettrodo unipolare e potenziali d'azione intracellulari di cardiomiociti all'interno della fetta sono registrati con un elettrodo di vetro nitido.
Introduction
Le fette di tessuto sottile sono state utilizzate frequentemente nella scienza di base poiché Yamamot e Mcllwain hanno mostrato nel 1966 che l'attività elettrica delle fette del cervello è mantenuta in vitro 1 . Da allora, studi elettrofisiologici e farmacologici sono stati condotti su fette da cervello 2 , fegato 3 , polmone 4 e tessuto miocardico 5 , 6 , 7 . Le prime registrazioni di patch-clamp in fette ventricolari da cuori di ratto neonatale sono state descritte nel 1990 8 , ma questa tecnica è caduta nell'oblio per un certo tempo. Più di un decennio più tardi, il nostro gruppo ha stabilito un nuovo metodo per preparare le embrioni murine 9 , le neonate 10 e le 11 fette di cuore adulte. Queste fette di tessuto vitale possono essere utilizzate per esperimenti acuti (fetta adultaS possono essere coltivati per diverse ore) o esperimenti di coltura a breve termine (fette embrionali e neonatali possono essere coltivate per alcuni giorni). Le fette mostrano in vivo caratteristiche elettrofisiologiche simili e una diffusione di eccitazione omogenea valutata con potenzialità di azione dell'elettrodo acuto e registrazioni a matrice di microelettrodi 11 . Grazie alla loro morfologia "bidimensionale", consentono l'accesso diretto degli elettrodi di registrazione a tutte le regioni del ventricolo, che li rende uno strumento interessante per le indagini elettrofisiologiche e solleva nuove opzioni sperimentali rispetto ai cuori interi perfezionati da Langendorff. La risposta del farmaco delle fette ai bloccanti del canale ionico come verapamil (bloccante canale L-tipo Ca 2+ ), lidocaina (bloccante Na + -cannel), 4-aminopiridina (bloccante K + -kanelare dipendente dalla tensione non selettiva) e linopirdina (KCNQ K + – blocco canale) 9 , 11 </suP> corrispondevano a effetti noti sui cardiomiociti dissociati. Le misure di forza isometrica hanno rivelato una relazione positiva di frequenza di forza e suggerito fortemente la funzione contrattuale intatta 10 . Questi risultati hanno dimostrato che le fettine ventricolari murine sono adatte come un modello di tessuto in vitro per studi fisiologici e farmacologici. Inoltre, le fetture ventricolari di cuori riceventi in combinazione con registrazioni di elettrodo nitide hanno dimostrato di essere uno strumento molto utile per caratterizzare l'integrazione elettrica e meccanica, nonché la maturazione dei cardiomiociti fetali 12 , 13 e 14 trapiantati.
In sintesi, le fetture ventricolari sono un prezioso e ben consolidato modello di tessuto multicellulare e devono essere considerati complementari ai cardiomiociti dissociati e ai cuori perfezionati da LangendorffNella ricerca cardiovascolare, con il grande vantaggio di fornire una struttura tissutale in vivo (in contrasto con le cellule dissociate), nonché l'accesso diretto delle tecnologie di misura come le registrazioni di elettrodo nitido a tutte le regioni del cuore (in contrasto con i preparati cardiaci interi).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fetture ventricolari consentono studi elettrofisiologici, farmacologici e meccanici con una struttura tissue preservata in vivo e accesso diretto della tecnologia di misura a tutte le regioni del cuore. Le proprietà del potenziale fisiologico di azione sono state dimostrate in fette embrionali, neonatali e adulti 9 , 10 , 11 . La vitalità delle fette, ad eccezione degli strati superficiali direttamente danneggiati…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il sostegno offerto dai laboratori e dalla struttura animale dell'Istituto di Neurofisiologia. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Walter und Marga Boll-Stiftung, dalla Köln Fortune e dalla Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
Referências
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