Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Murin Kısa Eksenli Ventriküler Kalp Dilimleri
Summary
Burada, yetişkin farelerden canlı ventriküler dilimlerin hazırlanmasını ve keskin elektrodun hareket potansiyel kayıtları için kullanımlarını açıklıyoruz. Bu çok hücreli müstahzarlar , in vitro olarak elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar için değerli bir model oluşturan, korunmuş bir in vivo doku yapısı sağlar.
Abstract
Fare kardiyomiyositleri , in vitro kardiyak fizyoloji çalışmaları ve yeni tedavi stratejileri için yoğun şekilde kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ayrışmış kardiyomiyositlerin çok hücreli preparatları, kalbin hem mekanik hem de elektrofizyolojik özelliklerini etkileyen kardiyomiyositlerin, miyositlerin ve hücre dışı matrisin in vivo yapısının kompleksini temsil etmez. Burada, korunmuş in vivo doku yapısı ile yetişkin fare kalplerindeki canlı ventriküler dilimleri hazırlamak için bir teknik ve elektrofizyolojik kayıtlara uygunluğunu göstermek için bir teknik açıklanmaktadır. Kalbin eksizyonundan sonra, ventriküller atriyumdan ayrılır, 2,3-butandion monoksim içeren Ca2 + içermeyen çözelti ile perfüzyonlanır ve% 4'lük düşük eriyikli agaroz blok içine gömülür. Blok titreşen bir bıçakla mikrotom üzerine yerleştirilir ve 150-400 μm kalınlığa sahip doku dilimleri titreşimi serbest bırakarak hazırlanır60 Hz'de bıçak sıklığı ve bıçağı mümkün olduğunca yavaş ileri hareket ettirerek. Dilimlerin kalınlığı diğer uygulamalara bağlıdır. Dilimler buz soğukluğundaki Tyrode çözeltisinde 0.9 mM Ca 2+ ve 2,3-butandion monoksim (BDM) ile 30 dakika süreyle saklanır. Ardından, BDM'yi yıkamak için dilimler 37 ° C DMEM'ye 30 dakika boyunca aktarılır. Dilimler, kesici elektrodlar veya mikro elektrot dizileri ile elektrofizyolojik çalışmalar için, kontraktil fonksiyonu analiz etmek için güç ölçümleri için veya nakledilen kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin ve konakçı doku arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılabilir. Keskin elektrot kayıtları için, bir dilim, ters çevrilmiş mikroskopun ısıtma plakasındaki 3 cm'lik hücre kültürü çanağına yerleştirilir. Dilim bir tek kutuplu elektrot ile uyarılır ve dilim içindeki kardiyomiyositlerin hücre içi eylem potansiyelleri keskin bir cam elektrot ile kaydedilir.
Introduction
Yamamot ve Mcllwain 1966'da beyin dilimlerinin elektriksel aktivitesinin in vitro muhafaza edildiğini gösterdiklerinden beri temel bilimde ince doku dilimleri sıklıkla kullanılmıştır. O zamandan beri, beyin 2 , karaciğer 3 , akciğer 4 ve miyokard dokusu 5 , 6 , 7 dilimleri üzerinde elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar yürütülmüştür. Yenidoğan sıçan kalplerindeki ventriküler dilimlerde ilk yama-kelepçe kayıtları 1990'da 8'de tanımlanmıştır, ancak bu teknik bir süre unutulmaya uğradı. Birkaç yıl sonra grubumuz, fare embriyonik 9 , neonatal 10 ve erişkin 11 kalp dilimlerini hazırlamak için yeni bir yöntem geliştirdi. Bu canlı doku dilimleri akut deneyler için kullanılabilir (erişkin dilimS birkaç saat ekilebilir) veya kısa vadeli kültür deneyleri (embriyonik ve yenidoğan dilimleri birkaç gün boyunca yetiştirilebilir). Kesitler elektrofizyolojik özelliklere benzer şekilde in vivo olarak gösterirler ve keskin elektrot aksiyon potansiyeli ve mikro elektrot dizisi kayıtları ile değerlendirildiğinde homojen bir uyarılma yayılır 11 . "İki boyutlu" morfolojilerinden dolayı kayıt elektrotlarının ventrikülün tüm bölgelerine doğrudan erişmelerine izin veriyorlar, bu da elektrofizyolojik araştırmalar için ilginç bir araç haline getiriyor ve Langendorff tarafından perfüze edilmiş kalpler ile karşılaştırıldığında yeni deneysel seçenekler getiriyor. Dilimlerin verapamil (L-tipi Ca2 + -kanal bloke edicisi), lidokain (Na + -kanal bloke edicisi), 4-aminopiridin (seçici olmayan voltaja bağımlı K + -kanal bloke edici) ve linopirdin (KCNQ K) gibi ilaçların iyon tutucu etkisi + -kanal bloke edici) 9 , 11 </suP> ayrışmış kardiyomiyositlerde bilinen etkilere karşılık gelmektedir. İzometrik kuvvet ölçümleri pozitif bir kuvvet frekansı ilişkisi ortaya koydu ve güçlü kasılma fonksiyonu önerdi10. Bu bulgular, sıçanın ventriküler dilimlerinin fizyolojik ve farmakolojik çalışmalar için in vitro bir doku modeli olarak uygun olduğunu göstermiştir. Ayrıca, kesici elektrot kayıtları ile birlikte alıcı kalplerin ventriküler dilimleri, transplanted fetal 12 , 13 , 14 ve kök hücre kaynaklı 15 kardiyomiyositlerin olgunlaşması yanı sıra elektriksel ve mekanik entegrasyonu karakterize etmek için çok yararlı bir araç olduğu kanıtlanmıştır.
Özetle, ventriküler dilimler değerli ve iyi kurulmuş bir çok hücreli doku modeli olup ayrışmış kardiyomiyositleri ve Langendorff perfüze edilen kalpler için tamamlayıcı olarak düşünülmelidir(Dissociated hücrelere karşıt olarak) bir in vivo benzeri doku yapısı sağlamanın yanı sıra keskin elektrot kayıtları gibi (kalp preparatlarının aksine) kalbin tüm bölgelerine doğrudan erişim sağlayan en büyük avantajı olan kardiyovasküler araştırmalardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ventriküler dilimler, korunmuş bir in vivo doku yapısı ve ölçme teknolojisinin kalbin tüm bölgelerine doğrudan erişimi ile elektrofizyolojik, farmakolojik ve mekanik çalışmalara olanak tanır. Fizyolojik aksiyon potansiyel özellikleri embriyonik, neonatal ve erişkin dilimlerde gösterilmiştir 9,10,11. Dilimleme işlemi ile doğrudan hasar gören yüzey tabakaları haricindeki dilimlerin canlılığı, canlılık boyaması ile teyit edilmiştir 9 . Burada açıklandığı …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalıştaylar ve Nörofizyoloji Enstitüsünün hayvan tesisi tarafından sağlanan desteği onaylıyoruz. Bu çalışma Walter und Marga Boll Stiftung, Köln Fortune ve Deutsche Stiftung für Herzforschung tarafından desteklendi.
Materials
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 ml Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27Gx3/4“ Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20G 11/2“ Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCL | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
Referências
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts–a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
