Analyse approfondie de la méthylation d'ADN en utilisant un procédé de capture de domaine de liaison au méthyl-CpG dans les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique
Summary
Ce travail décrit un protocole de séquençage optimisé du domaine de liaison au méthyl-CpG (MBD) et une canalisation de calcul pour identifier des régions riches en CpG différentiellement méthylées chez les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique (CLL).
Abstract
Le rôle des ARN non codants longs (lncRNAs) dans le cancer est à l'avant-garde en raison de l'intérêt croissant pour la compréhension de leurs fonctions mécanistes pendant le développement et la progression du cancer. Malgré cela, la régulation épigénétique globale des ARNnc et des séquences répétitives dans le cancer n'a pas été bien étudiée, en particulier dans la leucémie lymphocytaire chronique (CLL). Cette étude se concentre sur une approche unique: la capture à base d'immunoprécipitation de fragments d'ADN méthylés à double brin en utilisant des protéines de liaison au méthyl-liaison (MBD), suivi du séquençage de la prochaine génération (MBD-seq). Des échantillons de patients CLL appartenant à deux sous-groupes pronostiques (5 échantillons mutés IGVH + 5 échantillons non mutés IGVH) ont été utilisés dans cette étude. L'analyse a révélé 5 800 hyperméthylés et 12 570 gènes méthylés différentiellement spécifiques de CLL hypométhylés (cllDMGs) par rapport aux témoins sains normaux. Il est important de noter que ces résultats ont identifié plusieurs ARNc linéaires différenciés par CLL, différentiellement méthylés.Des éléments pétitionnels et des gènes codant pour des protéines ayant une valeur pronostique potentielle. Ce travail décrit un protocole détaillé pour un pipeline MBD-seq et bioinformatique développé pour l'analyse complète des profils globaux de méthylation dans des régions riches en CpG utilisant des échantillons de patients CLL. Enfin, un gène codant pour la protéine et un ARNmc ont été validés en utilisant le pyrosequencing, qui est une méthode hautement quantitative pour analyser les niveaux de méthylisation du CpG afin de corroborer davantage les résultats du protocole MBD-seq.
Introduction
L'utilisation de techniques de séquençage de la prochaine génération pour analyser les profils globaux de méthylation de l'ADN a été de plus en plus populaire au cours des dernières années. Des essais de méthylation à l'échelle du génome, y compris les méthodes à base de microarray et de microarray, ont été développés sur la base de ce qui suit: la conversion de bisulfite d'ADN génomique, les digestion enzymes de restriction sensibles à la méthylation et l'immunoprécipitation d'ADN méthylé en utilisant des anticorps spécifiques de méthyle CpG .
La méthylation d'ADN aberrante est l'une des caractéristiques de la leucémie et des lymphomes, y compris la leucémie lymphocytaire chronique (CLL). Plus tôt, plusieurs groupes, dont le nôtre, ont caractérisé les profils de méthylation de l'ADN de différents sous-groupes de pronostic de CLL et des contrôles de cellules B normaux et sains utilisant la conversion de bisulfite d'ADN génomique, suivis de méthodes à base de micro-ensembles ou de séquençage génomique complet 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. La conversion de bisulfite d'ADN génomique conduit à la désamination des cytosines non modifiées à l'uracile, laissant les cytosines méthylées modifiées dans le génome. Une fois converti, l'état de méthylation de l'ADN peut être déterminé par amplification et séquençage par PCR en utilisant différentes méthodes quantitatives ou qualitatives, telles que le séquençage de bisulfites à base de micro-ensembles ou de génome entier (WGBS). Bien que les méthodes basées sur la conversion du bisulfite présentent de nombreux avantages et sont largement utilisées dans différents types de cancer pour analyser les niveaux de méthylation de l'ADN, il existe quelques inconvénients associés à cette technique. Le séquençage WGBS permet une résolution par paire unique avec des quantités inférieures d'ADN et est l'option la mieux adaptée pour analyser un grand nombre d'échantillons. Cependant, cette méthode ne parvient pas à différencier les modifications entre les niveaux 5 mC et 5 hmC dans le génome 5 , 6 . En outre, les méthodes basées sur les microarray n'offrent pas complète cExcès de génome.
Dans une étude récente de notre laboratoire 7 , les méthodes basées sur l'immunoprécipitation, plutôt que la conversion des bisulfites, ont été utilisées pour identifier des régions hautement riches en CpG, différentiellement méthylées à l'échelle mondiale chez des patients CLL et des témoins sains normaux. Le séquençage de prochaine génération (MBD-seq) du domaine de liaison au méthyl-CpG (MBD), l'enrichissement de l'ADN fragmenté double brin dépend du degré de méthylation du CpG. Ce procédé peut surmonter les inconvénients du procédé de conversion du bisulfite et peut également fournir une couverture de la méthylisation du CpG à l'échelle du génome de manière indépendante et indépendante de la PCR. De plus, contrairement aux méthodes de microarray basées sur la conversion au bisulfite, MBD-seq peut être utilisé pour analyser l'état de méthylation des éléments répétitifs, tels que les longs éléments nucléaires entremêlés (LINE), les éléments nucléaires intermédiaires courts (SINE), les répétitions terminales longues (LTRS) Etc. Cependant, par rapport aux méthodes de conversion des bisulfites,Un protocole MBD-seq nécessite une quantité relativement importante d'ADN d'entrée. En outre, la qualité des lectures séquentielles et les données dépendent de la spécificité, de l'affinité et de la qualité des anticorps utilisés.
L'étude actuelle explique un protocole MBD-seq détaillé pour enrichir l'ADN méthylé pour le séquençage de la prochaine génération. Il utilise un kit commercial d'enrichissement en liaison d'ADN méthylé (répertorié dans la table Matériaux ), ainsi qu'un pipeline informatique pour visualiser et interpréter les données de séquençage de la méthylation afin d'identifier les régions hyper-hypométhylées spécifiques de CLL par rapport aux témoins sains normaux. Fondamentalement, cette méthode utilise la capacité de la MBD de l'interaction de la protéine MBD2 humaine avec les CpG méthylées pour extraire l'ADN enrichi en CpG méthylées, ce qui est suivi du séquençage à haut débit de l'ADN méthylé.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBD-seq est une technique rentable, basée sur l'immunoprécipitation qui peut être utilisée pour étudier les modèles de méthylation avec une couverture complète du génome. Les deux MeDIP seq (immunoprécipitation de l'ADN méthylé suivi du séquençage) et MBD-seq entraînent l'enrichissement de l'ADN méthylé riche en CpG. Cependant, MBD-seq montre plus d'affinité envers la liaison à des régions riches en CpG par rapport à MeDIP seq 19 . À l'aide d'un k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le Conseil suédois de la recherche, la Société suédoise du cancer, la Fondation Knut et Alice Wallenberg (KAW) et FoU VästraGötalandsregionen.
Materials
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
Referências
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