慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析
Summary
この研究では、最適化されたメチル-CpG結合ドメイン（MBD）配列決定プロトコルと、慢性リンパ球性白血病（CLL）患者において差別的にメチル化されたCpGリッチ領域を同定するための計算パイプラインについて記載する。
Abstract
癌における長い非コードRNA（lncRNA）の役割は、癌の発達および進行中のそれらの機構的機能の理解への関心の高まりから、最前線に来ている。それにもかかわらず、特に慢性リンパ球性白血病（CLL）において、lncRNAおよび癌における反復配列の全体的なエピジェネティックな制御は十分に研究されていない。この研究では、メチル結合ドメイン（MBD）タンパク質を用いた二本鎖メチル化DNA断片の免疫沈降に基づく捕捉、次世代シーケンシング（MBD-seq）に続くユニークなアプローチに焦点を当てています。 2つの予後サブグループ（5つのIGVH変異サンプル+ 5つのIGVH非変異サンプル）に属するCLL患者サンプルをこの研究で使用した。分析により、正常な健康対照と比較して5,800の過剰メチル化および12,570低メチル化CLL特異的差異的メチル化遺伝子（cllDMG）が明らかにされた。重要なことに、これらの結果は、いくつかのCLL特異的な、差異的にメチル化されたlncRNAを同定した鋭い要素、および予後の価値を潜在的に有するタンパク質コード遺伝子が含まれる。この研究は、CLL患者試料を用いた高度にCpGが豊富な領域における全体的メチル化プロファイルの包括的な解析のために開発されたMBD-seqおよびバイオインフォマティクスパイプラインの詳細なプロトコルを概説している。最後に、タンパク質コード遺伝子およびlncRNAを、パイロシーケンシングを用いて検証した。これは、CpGメチル化レベルを分析してMBD-seqプロトコールからの知見をさらに裏づける高度に定量的な方法である。
Introduction
近年、全世界のDNAメチル化プロファイルを解析するための次世代シーケンシング技術の使用が増えています。メチル化感受性制限酵素消化、およびメチルCpG特異的抗体を用いたメチル化DNAの免疫沈降に基づいて、ゲノムワイドメチル化アッセイ（マイクロアレイおよび非マイクロアレイベースの方法を含む）を開発した。
異常なDNAメチル化は、慢性リンパ球性白血病（CLL）を含む白血病およびリンパ腫の特徴の1つである。以前は、私たちを含むいくつかのグループが、ゲノムDNAの重亜硫酸塩変換、マイクロアレイベースの方法または全ゲノム配列決定1,2,3を用いて、異なるCLL予後サブグループおよび正常な健康なB細胞コントロールのDNAメチル化プロファイルを特徴付けた、 <sup class = "xref"> 4。ゲノムDNAの重亜硫酸塩の変換は、修飾されていないシトシンのウラシルへの脱アミノ化をもたらし、修飾メチル化シトシンをゲノムに残す。一旦変換されると、DNAのメチル化状態は、マイクロアレイベースまたは全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（WGBS）のような異なる定量的または定性的方法を用いたPCR増幅および配列決定によって決定することができる。重亜硫酸塩変換に基づく方法は多くの利点を有し、DNAメチル化レベルを分析するために異なる癌型で広く使用されているが、この技術に関連するいくつかの欠点がある。 WGBSシークエンシングにより、より少ないDNA量で1塩基対の分解能が得られ、多数のサンプルを分析するのに最適なオプションです。しかしながら、この方法は、ゲノム5,6中の 5mCレベルと5hmCレベルとの間の改変を区別することができない。さらに、マイクロアレイに基づく方法は完全なcを提供しないゲノムの超過。
私たちの研究室7の最近の研究では、重亜硫酸塩変換ではなく、免疫沈降に基づく方法を用いて、CLL患者および正常な健常対照における全体的な規模で高度にCpGが豊富な差別的にメチル化された領域を同定した。 Inmethyl-CpG結合ドメイン（MBD）の次世代配列決定（MBD-seq）では、二本鎖断片化DNAの濃縮はCpGメチル化の程度に依存する。この方法は、重亜硫酸塩変換法の欠点を克服することができ、バイアスのないPCRおよびPCR非依存的な方法でCpGメチル化のゲノムワイドカバレッジを提供することもできる。さらに、重亜硫酸塩変換に基づくマイクロアレイ法とは異なり、MBD-seqを使用して、長い散在性核要素（LINE）、短い散在核要素（SINE）、長い末端反復配列（LTRS）などの反復要素のメチル化状態を分析することができる。 等 。しかしながら、亜硫酸水素塩の変換方法と比較して、MBD-seqプロトコルは比較的大量の入力DNAを必要とする。また、配列決定の質およびデータは、使用される抗体の特異性、親和性および品質に依存する。
現在の研究では、次世代シーケンシングのためにメチル化DNAを濃縮するための詳細なMBD-seqプロトコルについて説明しています。これは市販のメチル化DNA結合濃縮キット（ 材料表に記載されている）と、メチル化シーケンシングデータを視覚化して解釈してCLL特異的なハイパーサイトおよびハイポメチル化領域を同定する計算パイプラインを使用しています。基本的に、この方法は、メチル化CpGで富化されたDNAを抽出するためのメチル化CpGとのヒトMBD2タンパク質相互作用のMBDの能力を利用し、メチル化DNAのハイスループットシーケンシングが続く。
Protocol
Representative Results
Discussion
MBD-seqは、費用対効果の高い免疫沈降に基づく技術であり、完全なゲノムワイドカバレッジでメチル化パターンを研究するために使用できます。 MeDIP seq（メチル化DNA免疫沈降の後にシーケンシング）およびMBD-seqの両方が、CpGが豊富なメチル化DNAの濃縮をもたらす。しかしながら、MBD-seqは、MeDIP seq19と比較した場合、高度にCpGに富む領域への結合に対するより高い親和性を示す。メチル結合濃…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、スウェーデン研究評議会、スウェーデン癌協会、クヌート・アンド・アリス・ヴァレンベルグ財団（KAW）、およびフォア・ヴェストラゴタランセリージョン・オブ・ザ・イヤーによって支持された。
Materials
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
Referências
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