Analisi completa della metilazione del DNA usando un metodo basato sulla cattura di dominio di metile-CpG in pazienti con leucemia linfocitica cronica
Summary
Questo lavoro descrive un protocollo di sequenziamento del dominio di binding di metil-CpG (MBD) ottimizzato e una pipeline computazionale per identificare le regioni ricche di CpG riccamente differenziate in pazienti con leucemia linfocitaria cronica (CLL).
Abstract
Il ruolo di lunghi RNA non codificanti (lncRNA) nel cancro sta arrivando all'avanguardia a causa del crescente interesse per comprendere le loro funzioni meccaniche durante lo sviluppo e la progressione del cancro. Nonostante questo, la regolazione epigenetica globale dei lncRNA e delle sequenze ripetitive nei tumori non è stata ben studiata, in particolare nella leucemia linfocitaria cronica (CLL). Questo studio si concentra su un approccio unico: la cattura a base di immunoprecipitazione di frammenti di DNA a doppio filamento e metilato usando proteine del dominio di legame di metile (MBD), seguito da sequenziamento di nuova generazione (MBD-seq). In questo studio sono stati utilizzati campioni di pazienti CLL appartenenti a due sottogruppi prognostici (5 campioni mutati IGVH + 5 IGVH campioni non mutati). L'analisi ha rivelato 5.800 ipermetilati e 12.570 glicini differenzialmente metilati specifici CLL-ipometilati (cllDMGs) rispetto ai normali controlli sani. Importante, questi risultati hanno identificato diversi lncRNA specifici CLL, differenzialmente metilatiElementi petitive e geni che codificano la proteina con potenziale valore prognostico. Questo lavoro descrive un protocollo dettagliato per una pipeline MBD-seq e bioinformatica sviluppata per l'analisi completa dei profili di metilazione globale in regioni altamente ricche di CpG usando campioni di pazienti CLL. Infine, un gene codificante proteina e un lncRNA sono stati convalidati usando il pirosequencing, che è un metodo altamente quantitativo per analizzare i livelli di metilazione di CpG per corroborare ulteriormente i risultati del protocollo MBD-seq.
Introduction
L'utilizzo di tecniche di sequenziamento di nuova generazione per l'analisi dei profili di metilazione del DNA globale è diventato sempre più popolare negli ultimi anni. I metodi di metilazione a livello genomico, compresi metodi basati su microarray e non microarray, sono stati sviluppati in base a quanto segue: la conversione di bisulfite di DNA genomico, digestioni enzimatiche di restrizione sensibile alla metilazione e l'immunoprecipitazione del DNA metilato usando anticorpi specifici di metil CpG .
La metilazione aberrante del DNA è uno dei segni distintivi della leucemia e dei linfomi, inclusa la leucemia linfocitica chirurgica (CLL). In precedenza, diversi gruppi compresi i nostri caratterizzavano i profili di metilazione del DNA di diversi sottogruppi CLL e dei normali e sani controlli delle cellule B usando la conversione bisulfa del DNA genomico seguita da metodi basati su micro-array o sequenziamenti interi genomi 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. La conversione di bisulfite del DNA genomico conduce alla deaminazione di citosine non modificate all'uracil, lasciando le citosine metilate modificate nel genoma. Una volta convertito, lo stato di metilazione del DNA può essere determinato mediante amplificazione e sequenza PCR utilizzando diversi metodi quantitativi o qualitativi, come il sequenziamento di bisulfite a base di micro-array o intero genoma (WGBS). Sebbene i metodi basati sulla conversione di bisolfito abbiano molti vantaggi e sono ampiamente usati in diversi tipi di cancro per analizzare i livelli di metilazione del DNA, ci sono alcuni inconvenienti associati a questa tecnica. Il sequenziamento di WGBS consente la risoluzione di una coppia di basi con quantità minori di DNA ed è l'opzione migliore per analizzare un gran numero di campioni. Tuttavia, questo metodo non riesce a differenziare le modifiche tra i livelli di 5 mC e 5 hmC nel genoma 5 , 6 . Inoltre, i metodi basati su microarray non offrono completa cSopravvivenza del genoma.
In un recente studio del nostro laboratorio 7 , sono stati utilizzati metodi basati su immunoprecipitazione, piuttosto che la conversione di bisulfite, per identificare regioni ricche di CpG ricche e differenziate su scala globale nei pazienti CLL e nei controlli normali sani. Il sequenziamento di prossima generazione (MBD-seq) del dominio di binding inmetil-CpG (MBD), l'arricchimento del DNA frammentato a doppio filamento dipende dal grado di metilazione di CpG. Questo metodo può superare gli inconvenienti del metodo di conversione di bisulfite e può anche fornire una copertura genomica della metilazione CpG in modo indipendente e indipendente dalla PCR. Inoltre, a differenza dei metodi di microarray basati su conversione a base di bisolfito, MBD-seq può essere utilizzato per analizzare lo stato di metilazione degli elementi ripetitivi, quali elementi nucleari interrati lunghi (LINEs), elementi nucleari interspersati corti (SINEs), ripetizioni terminali lunghe (LTRS) Ecc . Tuttavia, rispetto ai metodi di conversione di bisolfito,Un protocollo MBD-seq richiede una quantità relativamente elevata di DNA di input. Inoltre, la qualità dei sequenziamenti legge e i dati dipendono dalla specificità, affinità e qualità degli anticorpi utilizzati.
Lo studio corrente spiega un dettagliato protocollo MBD-seq per arricchire il DNA metilato per la sequenza di nuova generazione. Utilizza un kit di arricchimento di legame metilato commerciale (elencato nella tabella dei materiali ), nonché una pipeline computazionale per visualizzare e interpretare i dati di sequenziamento della metilazione per identificare le regioni iper- e ipometilate specifiche CLL rispetto ai controlli normali sani. Fondamentalmente, questo metodo utilizza la capacità dell'MBD dell'interazione con proteine umane MBD2 con CpG metilati per estrarre il DNA arricchito con CpG metilati, e questo è seguito dal sequenziamento ad alta percentuale di DNA metilato.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBD-seq è una tecnica basata su costo-efficacia basata sull'immunoprecipitazione che può essere utilizzata per studiare i modelli di metilazione con copertura completa a livello genomico. Sia MeDIP seq (immunoprecipitazione metilata DNA seguita da sequenziamento) e MBD-seq provocano l'arricchimento di DNA metilato ricco di CpG. Tuttavia, MBD-seq mostra maggiore affinità verso l'adesione a regioni ricche di CpG molto elevate rispetto a MeDIP seq 19 . Utilizzando un kit di arricchime…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal Consiglio di ricerca svedese, dalla Società cancro svedese, dalla fondazione Knut e Alice Wallenberg (KAW) e da FoU VästraGötalandsregionen.
Materials
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
Referências
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