Комплексный анализ метилирования ДНК с использованием метода Methyl-CpG-связывающего домена для захвата у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией
Summary
В этой работе описывается оптимизированный протокол секвенирования доменов с меченным CpG-связывающим доменом (MBD) и вычислительный конвейер для идентификации дифференцированных метилированных CpG-богатых областей у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией (CLL).
Abstract
Роль длинных некодирующих РНК (lncRNAs) в раке выходит на первый план из-за растущего интереса к пониманию их механистических функций при развитии рака и его прогрессировании. Несмотря на это, глобальная эпигенетическая регуляция lncRNAs и повторяющихся последовательностей в раке не была хорошо исследована, особенно при хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL). В этом исследовании основное внимание уделяется уникальному подходу: взятие иммунопреципитации двухцепочечных метилированных фрагментов ДНК с использованием белков с метиловым связыванием (MBD) с последующим секвенированием следующего поколения (MBD-seq). В этом исследовании использовались образцы пациентов с ХЛЛ, принадлежащие двум прогностическим подгруппам (5 мутантных образцов ИГВХ + 5 безмолекулярных образцов IGVH). Анализ выявил 5800 гиперметилированных и 12 570 гипометилированных CLL-специфических дифференцированных метилированных генов (cllDMG) по сравнению с нормальными здоровыми контролями. Важно отметить, что эти результаты выявили несколько CLL-специфических, дифференцированных метилированных lncRNAs, reМелкие элементы и белок-кодирующие гены с потенциальной прогностической ценностью. В этой работе описывается подробный протокол для трубопровода MBD-seq и биоинформатики, разработанный для всестороннего анализа глобальных профилей метилирования в богатых CpG областях с использованием образцов пациентов CLL. Наконец, ген, кодирующий белок, и lncRNA были проверены с использованием пиросеквенирования, который является высоко количественным методом для анализа уровней метилирования CpG для дальнейшего подтверждения результатов протокола MBD-seq.
Introduction
Использование технологий последующего секвенирования для анализа глобальных профилей метилирования ДНК в последние годы пользуется все большей популярностью. Анализы метилирования в масштабе всего генома, включая методы на основе микрочипов и не микрочипов, были разработаны на основе следующего: бисульфитная конверсия геномной ДНК, чувствительность к метилированию рестрикционных ферментов и иммунопреципитация метилированной ДНК с использованием метил-CpG-специфических антител ,
Метилирование ДНК аберранта является одним из признаков лейкемии и лимфом, включая хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ). Ранее несколько групп, в том числе наши, характеризовали профили метилирования ДНК различных прогностических подгрупп CLL и нормальные здоровые B-клеточные контрольные группы с использованием бисульфитной конверсии геномной ДНК с последующими методами на основе микро-матрицы или секвенированием цельного генома 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. Бисульфитная конверсия геномной ДНК приводит к дезаминированию немодифицированных цитозинов к урацилу, оставляя модифицированные метилированные цитозины в геноме. После преобразования статус метилирования ДНК может быть определен с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования с использованием различных количественных или качественных методов, таких как бисульфитное секвенирование на основе микроячейки или цельного генома (WGBS). Хотя методы, основанные на использовании бисульфита, имеют много преимуществ и широко используются в разных типах рака для анализа уровней метилирования ДНК, есть несколько недостатков, связанных с этим методом. Секвенирование WGBS позволяет разрешать однобазовую пару с меньшим количеством ДНК и является наилучшим подходящим вариантом для анализа большого количества образцов. Однако этот метод не позволяет дифференцировать модификации между уровнями 5 мК и 5 hmC в геноме 5 , 6 . Кроме того, методы на основе микрочипов не предлагают полного cИзбыток генома.
В недавнем исследовании из нашей лаборатории 7 методы, основанные на иммунопреципитации, а не конверсия бисульфита, были использованы для идентификации высококонцентрированных, дифференцированных метилированных областей CpG в глобальном масштабе у пациентов с ХЛЛ и нормального здорового контроля. Секвенирование следующего поколения inmethyl-CpG-связывающего домена (MBD) (MBD-seq), обогащение двухцепочечной фрагментированной ДНК зависит от степени метилирования CpG. Этот способ может преодолеть недостатки метода конверсии бисульфита и может также обеспечить общий охват генотипированием CpG в геноме несмещенным и ПЦР-независимым образом. Кроме того, в отличие от методов микрочипов на основе конверсии на основе бисульфита, MBD-seq может использоваться для анализа статуса метилирования повторяющихся элементов, таких как длинные вкрапленные ядерные элементы (LINE), короткие вкрапленные ядерные элементы (SINE), длинные концевые повторы (LTRS) И т.д. Однако по сравнению с методами конверсии бисульфита,Для протокола MBD-seq требуется относительно большое количество входной ДНК. Кроме того, качество чтения последовательности и данные зависят от специфичности, сродства и качества используемых антител.
В настоящем исследовании объясняется подробный протокол MBD-seq для обогащения метилированной ДНК для секвенирования следующего поколения. Он использует коммерческий набор метилированного ДНК-связывающего обогащения ( указанный в Таблице материалов ), а также вычислительный трубопровод для визуализации и интерпретации данных секвенирования метилирования для определения специфичных к ХЛЛ гипер- и гипометилированных областей по сравнению с нормальным здоровым контролем. В принципе, этот метод использует способность MBD взаимодействия человеческого белка MBD2 с метилированными CpG для экстракции ДНК, обогащенной метилированными CpG, и за этим следует высокопроизводительное секвенирование метилированной ДНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBD-seq является экономически эффективным методом иммунопреципитации, который может быть использован для изучения образцов метилирования с полным охватом генома. И MeDIP seq (метилированная ДНК-иммунопреципитация с последующим секвенированием), и MBD-seq приводят к обогащению обогащенной CpG-м?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Шведским исследовательским советом, Шведским онкологическим обществом, Фондом Кнут и Алисой Валленбергом (KAW) и FoU VästraGötalandsregionen.
Materials
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
Referências
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
