만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석
Summary
이 연구는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자에서 차별적으로 메틸화 된 CpG가 풍부한 부위를 확인하기 위해 최적화 된 메틸 -CpG 결합 도메인 (MBD) 시퀀싱 프로토콜과 계산 파이프 라인을 설명합니다.
Abstract
암에서의 긴 비 암호화 RNAs (lncRNAs)의 역할은 암 발달 및 진행 동안 그들의 기계적 기능을 이해하는데 점점 더 많은 관심을 가지고 있기 때문에 최전선에 서있다. 그럼에도 불구하고, lncRNA 및 암에서의 반복 서열에 대한 전 세계적 후성 조절은 특히 만성 림프 구성 백혈병 (CLL)에서 잘 조사되지 않았다. 이 연구는 독특한 접근 방식에 초점을 맞추고 있습니다 : 메틸 결합 도메인 (MBD) 단백질을 사용한 이중 가닥 메틸화 DNA 단편의 면역 침전 기반 포획, 차세대 시퀀싱 (MBD-seq). 2 개의 예후 소그룹에 속하는 CLL 환자 샘플 (5 개의 IGVH 돌연변이 샘플 + 5 개의 IGVH 돌연변이 샘플)이이 연구에 사용되었다. 분석 결과 정상 건강한 대조군에 비해 5,800 개의과 메틸화 및 12,570 개의 저 메틸화 CLL 특이 적 차별화 메틸화 유전자 (cllDMGs)가 밝혀졌습니다. 중요하게,이 결과는 몇몇 CLL 특이적이고 차별적으로 메틸화 된 lncRNA를 확인했다.소수성 요소 및 잠재적 인 예후 가치를 지닌 단백질 코딩 유전자를 포함한다. 이 연구는 CLL 환자 샘플을 사용하여 고도의 CpG가 풍부한 지역에서 전 세계적으로 메틸화 프로필을 포괄적으로 분석하기 위해 개발 된 MBD-seq 및 생물 정보학 파이프 라인에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 코딩 코딩 유전자와 lncRNA는 파이로 시퀀싱 (pyrosequencing)을 사용하여 검증되었으며, 이는 MBD-seq 프로토콜의 결과를 뒷받침하기 위해 CpG 메틸화 수준을 분석하는 고도의 정량 방법이다.
Introduction
최근 전 세계적 DNA 메틸화 프로파일을 분석하기위한 차세대 시퀀싱 기술의 사용이 증가하고 있습니다. 게놈 DNA의 bisulfite 변환, 메틸화 민감성 제한 효소 소화 및 메틸 CpG 특이 적 항체를 이용한 메틸화 DNA의 면역 침전 (immunoprecipitation)을 바탕으로 마이크로 어레이 및 비 마이크로 어레이 기반의 방법을 포함한 게놈 차원의 메틸화 분석법을 개발했다. .
불규칙한 DNA 메틸화는 만성 림프 성 백혈병 (CLL)을 비롯한 백혈병 및 림프종의 특징 중 하나입니다. 이전에, 우리를 포함한 여러 그룹은 게놈 DNA의 bisulfite 전환을 사용하여 다른 CLL 예후 소그룹과 정상, 건강한 B 세포 컨트롤의 DNA 메틸화 프로파일을 특징으로했으며, 마이크로 어레이 기반 방법 또는 전체 게놈 시퀀싱 1 , 2 , 3 , <sup class = "xref"> 4. 게놈 DNA의 바이 설 파이트 전환은 변형되지 않은 시토신의 우라실로의 탈아 민화를 가져오고 변형 된 메틸화 시토신을 게놈에 남긴다. 일단 변환되면, DNA의 메틸화 상태는 마이크로 어레이 기반 또는 전체 게놈 바이 설 파이트 시퀀싱 (WGBS)과 같은 다른 양적 또는 질적 방법을 사용하여 PCR 증폭 및 시퀀싱에 의해 결정될 수있다. bisulfite conversion-based 방법은 많은 장점이 있으며 DNA 메틸화 수준을 분석하기 위해 다양한 암 유형에서 널리 사용되지만이 방법과 관련된 몇 가지 단점이 있습니다. WGBS sequencing은 적은 양의 DNA로 single-base-pair resolution을 가능하게하며 많은 수의 시료를 분석하는데 가장 적합한 옵션입니다. 그러나,이 방법은 게놈 5 , 6 에서 5mC와 5hmC 수준 사이의 변형을 구별하는데 실패합니다. 또한, 마이크로 어레이 기반의 방법은 완전한 c게놈의 과잉.
우리 연구실 7 의 최근 연구에서, 바이 설 파이트 전환보다는 면역 침전 기반 방법을 사용하여 CLL 환자 및 정상적인 건강한 대조군에서 전 세계적으로 매우 높은 CpG가 풍부한 차별적으로 메틸화 된 지역을 확인했습니다. Inmethyl-CpG-binding domain (MBD) 차세대 염기 서열 분석 (MBD-seq)은 CpG 메틸화 정도에 따라 다르다. 이 방법은 bisulfite 전환 방법의 단점을 극복 할 수 있으며 또한 편파 및 PCR 독립적 인 방식으로 CpG 메틸화의 게놈 범위를 제공 할 수 있습니다. 또한 bisulfite conversion-based microarray 방법과 달리 MBD-seq는 long interspersed nuclear elements (LINEs), 짧은 interspersed nuclear elements (SINEs), long terminal repeats (LTRS)와 같은 반복적 인 요소의 메틸화 상태를 분석하는데 사용될 수있다. 등 . 그러나, 바이 설 파이트 전환 방법과 비교하여,MBD-seq 프로토콜은 비교적 많은 양의 입력 DNA를 필요로합니다. 또한 시퀀싱의 품질 및 데이터는 사용 된 항체의 특이성, 친 화성 및 품질에 따라 달라집니다.
현재의 연구는 차세대 시퀀싱을 위해 메틸화 된 DNA를 풍부하게하기위한 상세한 MBD-seq 프로토콜을 설명합니다. 그것은 상업적으로 메틸화 된 DNA 결합 농축 키트 ( Materials Table 에 열거 됨)와 정상적인 건강한 대조군에 비해 CLL 특이 적 하이퍼 및 저 메틸화 부위를 확인하기 위해 메틸화 시퀀싱 데이터를 시각화하고 해석하는 전산 파이프 라인을 사용합니다. 기본적으로이 방법은 methylated CpGs가 풍부한 DNA를 추출하기 위해 methylated CpGs와 인간 MBD2 단백질 상호 작용의 MBD 능력을 이용합니다. 그리고 메틸화 DNA의 높은 처리량 시퀀싱이 뒤 따릅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBD-seq는 비용 효율적이고 면역 침전에 기초한 기술로 완전한 게놈 범위로 메틸화 패턴을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. MeDIP seq (methylated DNA immunoprecipitation과 sequencing)와 MBD-seq는 모두 CpG가 풍부한 methylated DNA를 풍부하게 만든다. 그러나, MBD-seq는 MeDIP seq 19 와 비교할 때 높은 CpG가 풍부한 영역에 대한 결합에 대해 더 많은 친화도를 나타낸다. 메틸 결합 농축 키트를 사용하여 DNA?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 스웨덴 연구 협의회 (Swedish Research Council), 스웨덴 암 협회 (Swedish Cancer Society), 크 누트 (Knut) 및 앨리스 월 렌버그 재단 (Alice Wallenberg Foundation) (KAW) 및 FoU VästraGötalandsregionen에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
Referências
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