Summary
一个模块化的方法合成的N-糖的连接到铝氧化物涂层玻片 (动漫幻灯片) 已发展为糖微阵列, 它的使用, 以分析 HIV 广泛中和抗体已被证明。
Abstract
我们提出了一个高效的方法, 快速制备广泛的N连接的寡糖 (估计超过2万结构), 这是常见的人类糖蛋白。为了达到理想的结构多样性, 该策略开始于化学-酶合成三种 oligosaccharyl 氟化物模块, 其次是他们逐步α选择性 glycosylations 在 3-o和 6-o位置共核三的甘露糖残渣, 具有关键的β-mannoside 联系。我们进一步附上了N-糖到表面的氧化铝涂层玻璃 (动漫) 的幻灯片, 以创建一个共价键混合阵列分析异质配体与 HIV 抗体的相互作用。特别是, 新分离的 HIV-1 广义中和抗体 (bNAb), PG9 的结合行为, 对紧密间隔的人的混合物5GlcNAc2 (人5) 和 26 di sialylated 双 antennary 复合类型N-糖 (SCT) 在一个动漫阵列上, 开辟了一个新的途径, 以指导有效的免疫设计的 HIV 疫苗的开发。此外, 我们的动漫阵列体现了一个强大的工具, 研究其他 HIV 抗体的异配体结合行为。
Introduction
N-糖上的糖蛋白是共价链接到胺 (asn) 的残留的共识 asn-Xxx Ser/sequon, 这影响了几个生物过程, 如蛋白质构象, 抗原性, 溶解度, 和凝集素识别1,2. 由于其巨大的结构微异质性和高度分支的结构, 化学合成的N连接寡糖是一个重大的综合挑战。仔细选择保护组以调整积木的反应性, 在 anomeric 中心实现选择性, 以及适当使用启动子/活化剂是合成复合寡糖的关键因素。为了解决这个复杂的问题, 最近报告了大量的工作来推进N-糖合成, 目前已报道了3,4。尽管有这些健壮的方法, 但找到一种有效的方法来编写广泛的N-糖 (约 2万) 仍然是一个主要的挑战。
HIV-1 的快速突变率, 以实现广泛的遗传多样性和摆脱中和抗体反应的能力, 是最大的挑战, 以开发安全和预防性的疫苗对 HIV-15,6,7. HIV 病毒用于避免宿主免疫应答的一种有效策略是在转录糖蛋白 gp120 的后转化糖基化, 并有不同的N链接的糖从宿主糖化机械中获得8, 9。最近的一份报告关于重组单体 HIV-1 gp120 糖基化从人胚肾 (HEK) 293T 细胞, 建议发生结构不与一个典型的特定单元格模式10,11,12. 因此, 了解 HIV-1 bNAbs 的糖特性需要具有良好特征的 gp120 相关的N-糖结构, 其数量足以进行分析。
糖微阵列技术的发现提供了高吞吐量为基础的各种碳水化合物结合蛋白、病毒/细菌 adhesins、毒素、抗体和 lectines 的特异性的探索13,14.以阵列式芯片为基础的系统糖排列可以通过多表示15、16、17、18来确定有问题的低亲和力蛋白-糖相互作用。这种基于芯片的糖排列很方便地模拟了细胞的界面。为了丰富技术和克服与常规阵列格式相关的不均匀问题, 我们的小组最近开发了一个糖阵列在铝氧化物涂层玻璃 (动漫) 幻灯片上使用膦酸结束糖, 以提高信号强度,同质性和灵敏度19,20。
为了提高对新近分离的 HIV-1 中和抗体 (bNAbs) 的糖表位的了解, 我们开发了一种高效的模块化策略, 用于编写N链接的广泛的糖21 ,22将在一张动漫幻灯片上打印 (请参见图 1)。HIV-1 bNAbs 在一个动漫阵列上的特异性分析研究提供了异常检测的异糖结合行为的高强力 bNAb PG9 是孤立的 HIV 感染者的个人23,24,25。
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Protocol
1. D1/D2 臂模块的制备22
- 中间体2的制备
- 重启动材料1 (如图 2所示, p-甲氧基苯基-邻-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基-(1)-α-d-mannopyranoside (100 毫克, 0.204 摩尔)) 成15毫升管, 溶解在三缓冲器中 (25 毫米, pH 7.5) 含有二氯化锰 (MnCl2, 10 毫米) 达到最终糖浓度5毫米。
- 添加2苷二磷酸半乳糖 (UDP-Gal)。
- 添加150单位的酶β-1, 4 半转移从牛奶, 并孵化混合物在 37 oC 为 15 h。
- 15小时后, 进行薄层层析 (tlc), 通过在 tlc 板上发现反应混合物来指示起始物料的总消耗量, 用n-丁醇/乙酸/水 (h2O) 在1:1 中进行开发: 1 比和染色0.25 M 铈铵的溶液, 其次是加热。然后通过加热 90 oC 来淬火反应5分钟。
- 离心反应混合物以 2737 x g 为3分钟的速度, 并在聚丙烯酰胺凝胶柱顶部加载上清液 (参见材料表)。用蒸馏的 de 电离水洗该柱, 并收集具有 1-2 毫升的馏分的产品。
- 通过 TLC26对收集到的分数进行监控, 用n-丁醇: H2O: 乙酸在 1:1: 1 的比例, 并通过溶液中的铈钼酸铵后加热。Lyophilize27该产品含有分数, 以获得中间体 2 (115 毫克, 86%) 作为白色粉末。通过核磁共振28和质谱仪29 (参见补充数据文件) 来表征产品。
- 中间体3的制备
- 重启动材料2 (如图 2所示, p-甲氧基苯基-o-β-d-galactopyranosyl-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基-(1)-α-d-mannopyranoside (80 毫克, 0.122 摩尔)) 在15毫升管中, 溶解在三缓冲 (25 毫米, pH 7.5) 含有 MnCl 的2 (10 毫米), 以准备最终糖浓度5毫米。
- 添加2当量的鸟苷 5-diphospho β-l-藻二钠盐 (GDP-搞)。
- 添加150单位的酶α-1, 3 fucosyl 转移从幽门螺杆菌(Hp1-3FTΔ26695), 并孵化混合物在 37 oC 为 15 h。
- 按照步骤1.1.4。
- 按照步骤1.1.5。
- 按照步骤1.1.6 获得中间3 (82 毫克, 84%) 为白色粉末。通过核磁共振和质谱对产品进行表征 (见补充数据文件)。
- 4和5单元的编写
- 称量复合2, p-甲氧基苯基-o-β-d-galactopyranosyl-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基-(1)-α-d-mannopyranoside (0.230 g, 0.360 摩尔) 或复合3, p甲氧基苯基-o-β-d-galactopyranosyl-(1→4)-[α-l-fucopyranosyl-(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基]-(1)-α-d-mannopyranoside (0.100 克, 0.125 摩尔) 成25毫升单颈圆底烧瓶, 真空干燥30分钟。
- 从真空中取出烧瓶, 用氮气填充, 加入磁性搅拌棒, 用橡胶隔膜盖上, 并附上氮气气球。
- 将7毫升的干吡啶和3毫升的醋酸酐 (Ac2o) 注入到在 0 O的冰浴中放置的烧瓶中, 在室温下使用磁力搅拌器在 12-600 rpm 处搅动所产生的 700 h 的反应。在 0-10 毫巴的真空压力下, 在 50 oC 处使用旋转式蒸发器蒸发溶剂。
- 用30毫升二氯甲烷 (DCM) 稀释原油混合物, 然后用饱和水碳酸钠 (NaHCO3) (2 x 20 毫升) 萃取成50毫升分漏斗。
- 用 DCM (3 x 15 毫升) 重新提取水层, 并在硫酸钠上干燥复合有机层。用 DCM (5 毫升) 过滤和洗涤去除硫酸钠。用旋转蒸发器在400毫巴真空压力下用 40 oC 蒸发溶剂。
- 将原油混合物的溶液装入2毫升的 DCM 在二氧化硅床的顶部。
- 在甲苯和 0-20% 丙酮中含有甲苯和丙酮的混合物洗, 收集 5-10 毫升的馏分。
- 通过 TLC (步骤1.1.4 和 1.1.6), 用甲苯/丙酮 (7/3) 进行检测, 用铈铵钼酸盐溶液进行染色, 然后在热板上加热。
- 用旋转式蒸发器将含有分数的产品蒸发, 分别在72% 和85% 的产量中获得所需的白色泡沫。
- 将产品溶解为7毫升的乙腈: 甲苯: H2O 在4:2 中: 1 的比率在25毫升圆底烧瓶中。
- 添加铈铵 (2 当量), 冷却到 0 oC 使用冰浴。在室温下搅拌3小时 500-800 rpm 的反应。
- 薄层色谱法显示起动材料的总消耗量 (用甲苯/丙酮 (7/3) 进行薄层层析, 在 254 nm 时通过紫外吸收, 或用铈铵溶液加热后的染色进行可视化), 稀释反应混合物乙酸乙酯 (30 毫升) 和提取物与 H2O (15 x 2 毫升)。
- 用5毫升饱和氯化钠 (NaCl) 溶液提取复合有机层。
- 用旋转蒸发器在240毫巴真空压力下用 40 oC 蒸发溶剂。
- 将原油的溶液加载到硅床顶部的2毫升 DCM 中。洗的混合物含有甲苯和丙酮 (0-20% 丙酮在甲苯) 和收集分数 5-10 毫升。用色谱法监测收集的馏分, 用甲苯/丙酮 (7/3) 开发。
- 用旋转蒸发器在77毫巴真空和 40 oC 蒸发含有产品的馏分, 以获得所需的白色泡沫产品。
- 在25毫升的单颈圆底烧瓶中将各自的醇溶成10毫升的 DCM, 冷却到-30 oC。
- 添加 diethylaminosulfur 氟化物 (DAST, 2 当量)。将反应混合物在-30 oC 处搅拌2小时。
- 薄层色谱表明起动材料的消耗量 (以甲苯/丙酮 (4/1) 为原料进行薄层色谱, 在 254 nm 时通过紫外吸收法, 或用铈钼酸铵溶液进行染色, 然后加热), 用 DCM (30 毫升) 稀释反应混合物。, 然后用饱和 NaHCO3 (15 x 2 毫升) 冲洗。
- 用5毫升的饱和 NaCl 溶液提取复合有机层, 用无水硫酸镁干燥, 用 DCM (5 毫升) 洗涤后过滤混合物, 并将其收集成100毫升的单颈圆底烧瓶。
- 用旋转蒸发器在400毫巴真空压力下用 40 oC 蒸发溶剂。
- 在石英床顶部的2毫升 DCM 中装载原油产品的溶液。洗在甲苯和丙酮的混合物 (0-20% 丙酮在甲苯) 和收集分数 5-10 毫升。
- 用色谱法监测收集的馏分, 用甲苯/丙酮 (7/3) 开发。
- 用旋转蒸发器将含有馏分的产品蒸发以获得所需产品4, [23, 46 O 四β-d-galactopyranosyl]-(1→4)-[36 邻双乙酰-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基]-(1)-34, 6-triacetyl-α-d-mannopyranosyl 氟化物 (54% 以上2步) 和5, [23, 46 O-四-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[23, 4 邻 triacetyl α-l-fucopyranosyl-(1→3)-36 邻双乙酰-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基]-(1)-34, 6 O-triacetyl-α-d-mannopyranosyl 氟化物 (67% 超过2步) 作为白色固体。
- 通过核磁共振和质谱对产品进行表征 (见补充数据文件)。
2. 糖10的制备
- 中间7的制备
- 称银磺 (AgOTf) (0.039 克, 0.155 摩尔), 双 (四) 氯化铪 (IV) 二氯 (Cp2HfCl2) (0.041 克, 0.108 摩尔) 成25毫升的单颈圆底烧瓶, 在 schlenk 线真空下烘干30分钟, 将其从真空, 并填补它与氮气。
- 将新鲜干燥的4Å分子筛 (0.2 克) 转移到含有 AgOTf 和 Cp2HfCl2的烧瓶中, 加入磁性搅拌棒, 立即用隔膜盖, 并加入氮气气球。
- 用干玻璃注射器将3毫升干甲苯转移到烧瓶中。将反应混合物在室温下搅拌1小时, 然后冷却到 0 oC。
- 注入施主4 (图 2、0.043 g、0.046 摩尔) 和受体6的解决方案, 5-Azidopentyl-邻-2-邻乙酰基-46-邻-benzylidine-β-d-mannopyranosyl-(1→4)-o-(36-底邻-苄基-2-脱氧-2-(22, 2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-d-基)-(1→4)-邻 36-二邻-苄基-2-脱氧-2-(22, 2-trichloroethoxy) carbonylamino β-d-喃 (图 3, 0.045 克, 0.031 摩尔) 在3毫升甲苯入烧瓶通过隔膜使用10毫升注射器在0o将反应混合物在室温下搅拌3小时。
- 薄层层析显示起动材料的消耗量 (tlc, 发展与 DCM/丙酮 (8.5/1.5) 和可视化的紫外线吸收在 254 nm 或通过染色的铈钼酸铵后加热), 淬火反应通过注射10三乙胺的当量。
- 将分子筛通过硅藻土床过滤成50毫升的圆形底瓶, 再用10毫升乙酸乙酯洗涤。在 50 ml 分漏斗中, 用含水 NaHCO 的饱和溶液 (2 x 20 毫升) 萃取混合的有机层.用乙酸乙酯 (3 x 15 毫升) 提取水层。
- 用饱和 NaCl 溶液 (5 毫升) 提取有机层, 用无水硫酸镁干燥, 过滤混合物除去硫酸镁, 用乙酸乙酯 (3 x 15 毫升) 洗涤, 并在100毫升的圆底烧瓶中收集滤液。
- 用旋转蒸发器在240毫巴真空压力下用 40 oC 蒸发溶剂。
- 在石英床柱顶部的 DCM 中加载粗产品的解决方案。用含有 dcm 和丙酮的混合物 (dcm 中的0-10% 丙酮) 洗柱, 并收集5-10 毫升的分数。
- 用色谱法监测收集的分数, 用 DCM/丙酮 (8.5/1.5) 进行开发。用旋转蒸发器将含有产品的馏分蒸发, 以获得中间的7, 5-Azidopentyl-o-{[23, 46 o-四-β-d-galactopyranosyl]-(1→4)-[36 邻双乙酰-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基]-(1)-[34, 6-triacetyl-α-d-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2 邻乙酰基46邻-benzylidine-β-d-mannopyranosyl-(1→4) o-(36-二邻-苄基-2-脱氧-2-(22, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-d-基)-(1→4)-o-36-二邻-苄基 2-脱氧-2-(22, 2-trichloroethoxy) carbonylamino β-d-喃 (0.052 克, 70%), 作为白色泡沫。
- 通过核磁共振和质谱对产品进行表征 (见补充数据文件)。
- 中间8的制备
- 称 hexasaccharide 7 (图 3, 0.040 克, 0.016 摩尔) 成25毫升的单颈圆底烧瓶, 在真空下干燥1小时, 从真空中取出, 用氮气填充, 加入磁性搅拌棒, 用橡胶隔膜盖住。
- 转3毫升乙腈: 甲醇 (甲醇) (2:1 比) 进入烧瓶。
- 将p-甲苯磺酸一水合物 (0.001 克, 0.008 摩尔) 倒入反应烧瓶中, 并在 800 rpm 时搅动 5 h。
- tlc 表明起动材料的消耗 (tlc, 发展与 DCM/丙酮 (8.5/1.5), 和可视化的紫外线吸收在 254 nm 或通过染色的铈钼酸铵后加热), 淬火反应通过注射10三乙胺的当量。
- 用旋转蒸发器在337毫巴真空压力下用 40 oC 蒸发溶剂。
- 用大约2毫升的 DCM 将原油混合物溶解, 并将其载入二氧化硅床的顶部。
- 洗用 dcm 和丙酮 (dcm 中的 0-10% 丙酮) 混合, 收集 5-10 毫升的分数。用色谱法监测收集的分数, 用 DCM/丙酮 (8.5/1.5) 进行开发。用旋转蒸发器在400毫巴真空和 40 oC 蒸发溶剂。
- 在减压下烘干残渣, 使中间8, 5-Azidopentyl-o-(2 o-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced 压力→3)-2 o-乙酰基 4, 6 o-benzylidine-β-d-mannopyranosyl-(1→4)-o-(36-二邻苄基-2-脱氧-2-亚-β-d-基)-(1→4)-邻-36-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth。(图 3, 0.022 g, 57%) 为白色实心。通过核磁共振和质谱对产品进行表征 (见补充数据文件)。
- 中间9的制备
- 中间9 (图 3) 的准备工作是使用捐赠者5 (0.015 g, 13.2 µmol) 和受体8 (图 3, 0.020 g, 8.80 µmol) 完成的。
- AgOTf (0.011 克, 44.1 µmol) 和 Cp2HfCl2 (0.012 g, 30.8 µmol) 被用作助剂。
- 执行2.1.1 到2.1.10 的步骤以获取中间9, 5-Azidopentyl-O-{23, 46 邻四β-d-galactopyranosyl]-(1→4)-[36 邻双乙酰-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基]-(1)-[34, 6-o-triacetyl-α-d-mannopyranosyl]}-(1→3)-{23, 46 O-四-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[23, 4 邻 triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-36 邻双乙酰-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-基]-(1)-34, 6 O-triacetyl-α-d-mannopyranosyl}-(1→6)-[2-邻乙酰基β-d-mannopyranosyl-(1→4) o-(36-二邻-苄基 2-脱氧-2-(22, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-d-基)-(1 O-苄基 2-脱氧-2-(22, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-d-基)-d-glucopyra (0.010 g, 34%), as白色泡沫。
- 全球脱中间
- 称复合9 (0.010 克, 2.9 µmol) 为25毫升的单颈圆底烧瓶, 加入磁性搅拌棒、橡胶隔膜帽, 并附上氮气气球。
- 转移2毫升 1, 4 二: H2O (4:1) 进入烧瓶。在烧瓶中加入氢氧化锂 (LiOH) (0.005 克, 50%)。将反应混合物搅拌在 90-100 oC 处12小时, 并使其在 RT 处冷却。
- 用旋转式蒸发器蒸发溶剂, 在真空下将烧瓶干燥1小时, 用氮气填充, 将其从真空歧管中取出, 并用橡皮隔膜将其盖好。
- 将4毫升干吡啶和2毫升的醋酸酐注入瓶中, 通过隔膜使用10毫升注射器在 0 oc. 在 RT 处搅动 12 h 的反应混合物。
- 用旋转蒸发器在0-10 毫巴真空压力下用 50 oC 蒸发溶剂。
- 用30毫升 DCM 溶解原油混合物, 并在50毫升分漏斗中用饱和水 NaHCO3 (2 x 20 毫升) 提取溶液。
- 用 DCM (3 x 15 毫升) 重新提取水层。用旋转蒸发器蒸发溶剂。
- 在 C18 二氧化硅床的顶部, 在大约2毫升的 DCM 中加载产品的解决方案。洗水和甲醇混合物 (0-100% 的甲醇在水中) 和收集分数 5-10 毫升。
- 收集产品的分数, 并在减少压力下蒸发以获得所需的白色泡沫产品。
- 将该产品溶入5毫升的干甲醇中, 在25毫升圆底烧瓶中, 并将其盖上橡胶隔膜。
- 用冰浴将0.1 毫升的甲醇钠 (NaOMe) 转移到0° C, 冷却到12小时.
- 用旋转蒸发器除去溶剂, 在高真空下烘干产品。
- 在5毫升甲醇中溶解粗品: H2O: 乙酸 (6:3: 1)。
- 添加氢氧化钯 (OH)2) (50% 通过重量), 并在氢气气氛下使用氢气气球在15小时内搅动反应。
- 过滤反应通过硅藻土床和洗涤用2毫升甲醇跟随2毫升 dd 水。
- 用旋转蒸发器蒸发溶剂。
- 用大约1毫升的水溶解原油混合物, 并将其放在聚丙烯酰胺凝胶床的顶部 (参见材料表)。洗的产品与水和收集的分数 1-2 毫升。
- 用 TLC 法监测采集的分数, 用n-丁醇: H2O: 乙酸 (1:1: 1)。
- 收集产品的分数和 lyophilize 以获得所需的产品10, 5-Aminopentyl β-d-galactopyranosyl-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基-(1)-α-d-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-d-galactopyranosyl-(1→4)-(α-l-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基)-(1)-α-d-mannopyranosyl]-(1→6)-β-d-mannopyranosyl-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-喃 (0.002 克, 36%), 作为一个白色粉末
- 通过核磁共振和质谱对产品进行表征 (见补充数据文件)。
3. 膦酸尾糖的制备19,22
- 将各自的糖 (2-5 µmol) 放在5毫升的圆形底烧瓶中, 加入磁性搅拌棒, 并用橡皮隔膜将其盖上。
- 转移400µL 新鲜干胺。
- 添加 [2 (2 (2 (双 (苄) 磷) 乙二醇) 乙基 (2, 5-dioxopyrrolidin1 基) 碳酸酯] (10-25 µmol, 在众议院准备) 到糖溶液。搅拌 800 rpm 为5小时的混合物。
- 用旋转式蒸发器在 5-10 毫巴真空压力下蒸发溶剂, 在 40 oC。
- 在聚丙烯酰胺凝胶床的顶部溶解0.5 毫升水和负载的反应混合物 (参见材料表)。洗的产品使用水和收集的分数1-2 毫升。
- 通过 TLC26监视收集的分数。在 TLC 板上发现反应混合物, 添加0.25 米铈铵钼酸盐溶液;用热板加热。收集含有分数和 lyophilize 的产品, 以获得所需产品作为白色粉末。
- 将产品溶解在2毫升的水中, 添加 Pd (OH)2 (按重量 50%)。在氢气气氛下, 用氢气气球在15小时内搅动 800 rpm 的反应。
- 通过熔剂煅烧床过滤反应, 用2毫升甲醇洗涤, 然后用2毫升蒸馏的 de 电离水冲洗。用旋转蒸发器在300毫巴真空压力下用 40 oC 蒸发溶剂。
- 用大约1毫升的水溶解原油混合物, 并将其放在聚丙烯酰胺凝胶床的顶部 (参见材料表)。
- 洗的产品与水和收集的分数 1-2 毫升。通过 TLC26监视收集的分数。Lyophilize 的分数 (冷冻产品使用液氮, 然后放置在冻真空), 以获得所需的产品作为一个白色粉末。使用 D2O 作为溶剂, 通过核磁共振和质谱 (参见补充数据文件) 来表征产品。
4. 糖阵列
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镀铝玻璃玻片的制备 (动漫幻灯片)19,20,22
注: 在台湾新竹科学园的薄膜技术部、仪器技术研究中心和国家应用研究实验室, 制作了镀铝玻璃玻片。- 包覆的幻灯片, 真空密封它们, 以防止形成的脑, 并保持密封, 直到电化学反应表面阳极氧化。
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镀铝玻片表面阳极氧化19,20,22
- 设置温控箱在4° c。准备0.3 米草酸水溶液, 并将其放在冰浴中。取500毫升烧杯, 加入磁力搅拌器吧。
- 将0.3 米的草酸转移到500毫升的烧杯中, 然后将一个10厘米长的铂棒作为阴极放入溶液中。在阳极氧化过程中不断搅拌 (300 rpm) 草酸。
- 打开实验室追踪软件, 点击 "设置" 按钮然后 "功能选择扫电压"。将启动和停止电压设置为 25.8 V, 点数到 100, 符合 1, 然后扫描延迟到1200毫秒, 然后单击 "确定"。
- 将铝涂层玻璃的侧面夹紧朝向阴极。单击 "运行测试" 按钮。观察电流测量 (〜 8-10 mA)。
- 经表面阳极氧化后, 用双蒸馏水彻底冲洗滑块, 用氮气吹干, 然后贮存在30% 相对湿度室中, 直至进一步使用。
-
制作糖微阵列22
- 准备100µL 的所有单价糖 (I-XI) 在乙二醇10毫米浓度单独。
- 用印刷缓冲器 (80% 乙二醇和 20% de 电离水) 稀释上述糖, 使100µM 浓度。
- 对于异种配体的研究, 准备5µL 的个人 I-西糖, 并对每个增加5µL 的人5GlcNAc2 (1:1 比)。
- 打印微阵列由机器人别针 (参见材料目录) 由 0.6 nL 的证言早先准备的糖到动漫幻灯片31。
- 在装订试验前将打印的幻灯片存放在湿度控制的干燥箱中。
-
映射 HIV-1 广义中和抗体 PG9 的糖表位22
- 准备1毫升 BSA 包含 PBST 缓冲, 3% 瓦特/五
- 准备70µL 的 PG9 (50 µg/毫升) 在 PBST 缓冲区 (BSA 包含 PBST 缓冲区, 3% 瓦特/五)。
- 制备120µL 二级荧光标记抗体驴抗人 IgG (Alexa 氟647共轭) 50 µg/毫升在 PBST 缓冲 (BSA 包含 PBST 缓冲, 3% 瓦特/v) 在黑暗中。
- 混合初级抗体 (PG9) 和第二荧光标记抗体在1:1 比率 (60 µL 每)。在4° c 孵育30分钟的预混抗体。
- 将该滑块装入滑动孵化室, 分为16口井。将100µL 的预混抗体转移到糖阵列, 并在4° c 下孵育16小时。
- 吸管出预混抗体。取下滑梯孵化室。
- 先在 PBST 缓冲液 (PBS 和 0.05% Tween-20) 中冲洗滑块, 然后再用 de 电离水和旋转干燥 2000 x g。
- 打开微阵列图像分析软件 (请参见材料表)。插入带有阵列特征的幻灯片。
- 点击 "设置" 菜单, 将图像分辨率设置为每像素5µm, 波长在 635 nm, PMT450 和功率为100%。
- 点击 "扫描" 按钮开始成像幻灯片。
- 单击 "文件" 图标以 tif 格式保存扫描图像。
- 按照软件用户指南32执行图像分析。
- 计算荧光的总强度, 并使用图像处理软件33 (请参见材料表) 进行说明。
注意: 在这里, 所有数据点的平均百分比误差都是由误差线显示的。
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Representative Results
在图 1中介绍了一种用于合成N糖的广泛数组的模块化化学酶策略。该战略是基于这样一个事实, 即在开始时可以通过化学-酶合成三重要的模块, 然后在 3-o和/或 6-o位置的α特异性 mannosylation 共同N-糖的核心三。考虑到双、三、四 antennary 复杂类型的N-糖结构的结构多样性, 我们认为, 一组 oligosaccharyl 的捐赠者和预安装的烷基 handlecould 的核心三受体被用作启动生成所需结构多样性的材料 (图 1)。糖氟供体在构建复杂糖库中的适用性已在以前的21中得到了验证。
为了证明我们的策略的有效性, 选择了一个双 antennary 异构结构 (10, 图 3) 进行合成。D1 臂天线4和 D2 臂天线5的糖10是通过化学酶方法在大尺度上生成的。特别是, 双糖受体1是酶 galactosylated 使用β-1, 4-转移和苷 5 "-diphosphogalactose (UDP Gal), 以形成三2。接下来, 中间的2是 fucosylated 在 GlcNAc 3-O位置, 在存在α-1, 3-fucosyltransferase 从幽门螺杆菌(Hpα1,3FT), 以支付所需的 tetrasaccharide 3。对于化学结扎的核心, 构建块2和3是第一 peracetylated, 减少结束p-甲氧基苯酚组被删除。最后, 在 DAST 的存在下安装氟化物, 分别获得所需的模块4和5(图 2)。
有了所需的模块在手, 我们接下来进行的立体 3-O糖基化的4的核心三6的催化作用下银磺和 hafnocene 二氯化, 提供各自的 hexasaccharide 7(图 3)。苄保护那掩没 4, 6 OH 被去除了使用催化作用的p-甲苯磺酸 (p-TSA)。利用其反应性, 初级 6-OH 的8与氟化物模块5在类似的实验条件下发生反应, 以达到所需的 decasaccharide 9。最后, 全球脱被执行, 以获得糖10, 这是进一步的特点使用核磁共振和质谱 (见补充数据文件)。
在还原端含有戊胺尾的糖通过膦酸连接改性, 通过磷酸酯化学 (图 4) 将其附着在表面上。最后, HIV-1 bNAb PG9 被筛选为其糖特异性使用的同性恋和异质糖阵列, 以证明第一次 PG9 与相邻 heteroglycans 在 V1/V2 HIV-1 循环 gp120 的表面 (图 5)。
图 1: 用于准备N-糖的通用模块化策略.(A)此策略生成的糖的数目, 通常发生在人类糖蛋白上, 估计超过 2万. (B)由这种化学-酶方法制备的三种类型的模块, 可用于α-seletive glycosylations。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 化学模块的合成.i, UDP 半乳糖, β 1, 4 高尔特, 15 h, 86%;ii, 国民生产总值-藻, α 1, 3-FucT, 15 h, 84%;iii, (1) Ac2O, 吡啶, RT, 12 h;(1) 罐, ACN: 甲苯: H2O, (3) DAST, CH2Cl2,-30 OC. 罐头: 铈硝酸铵;DAST: Diethylaminosulfur 氟化。
产品命名:1, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-基-(1→ 2)-α-d mannopyranoside;2, 对-甲氧基苯基-β-d-galactopyranosyl-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基-(1)-α-d-mannopyranoside;3,p-甲氧基苯基-o-β-d-galactopyranosyl-(1→4)-[α-l-fucopyranosyl-(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基]-(1)-α-d-mannopyranoside;4, [23, 46 邻四β-d-galactopyranosyl]-(1→4)-[36 邻双乙酰-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基]-(1)-34, 6-邻 triacetyl-α-d-mannopyranosyl 氟;5,[23, 46 O-四-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[23, 4 邻 triacetyl α-l-fucopyranosyl (1→3)-36 邻双乙酰-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基]-(1)-34, 6-邻 triacetyl-α-d-mannopyranosyl 氟化物请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: D1/D2 臂模块的化学糖基化对核心受体.i, 4, AgOTf, Cp2HfCl2, 甲苯, 4 Å MS, 0 oC 到 RT, 70%;ii, p-TSA, 乙腈, RT, 57%;iii, 5, AgOTf, Cp2HfCl2, 甲苯, 4 Å MS, 0 oC 到 RT, 34%;iv, (1) LiOH, 14-二: H2O;90 oC, 12 小时;(2) Ac2O, 吡啶, 12 h;(3) NaOMe、甲醇、12小时;(4) Pd (OH)2, 甲醇: h2O: 甲酸 (5:3: 2), h2, 36%。AgOTf: 银色 trifluromethanesulfonate;Cp2HfCl2: 双 (茂) 二氯化铪, MS: 分子筛,产品名称: 7, 5-Azidopentyl o-{23, 46 o-四-β-d-galactopyranosyl]-(1→4)-[36 邻双乙酰-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基]-(1)-[34, 6 O-triacetyl-α-d-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-邻乙酰基46邻 benzylidine β-d-mannopyranosyl-(1→4) o-(36-二邻-苄基 2-脱氧-2-(22, 2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-d-基)-(1→4)-o-36-二邻-苄基-2-脱氧-2-(22, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-d-glucopyranosid。8, 5-Azidopentyl-o-(2 邻 acetyl-3,4,6-tri-O-苄基-α-d-mannopyranosyl-(1→3)-2-邻乙酰基-46-邻-benzylidine-β-d-mannopyranosyl-(1→4)-o-(36-二邻-苄基-2-脱氧-2-亚-β-d-基)-(1→4)-o-36-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside9, 5-Azidopentyl-o-{23, 46 邻四-β-d-galactopyranosyl]-(1→4)-[36 o-双乙酰-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基]-(1)-[34, 6 邻 triacetyl-α-d-mannopyranosyl]}-(1→3)-{23, 46-邻四-β-d-galactopyranosyl]-(1→4)-[23, 4 O triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-36 邻双乙酰-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基]-(1)-34, 6 邻 triacetyl α-d-mannopyranosyl}-(1→6)-[2 邻乙酰基β-d-mannopyranosyl-(1→4)-o-(36-二邻-苄基 2-脱氧-2-(22, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-d-基)-(1→4)-o-36-di o-苄基 2-脱氧-2-(22, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-Dglucopyranoside 10, 5-Aminopentyl-β-d-galactopyranosyl-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基-(1)-α-d-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-d-galactopyranosyl-(1→4) (α-l--fucopyranosyl-(1→3)-2-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基)-(1)-α-d-mannopyranosyl]-(1→6)-β-d-mannopyranosyl-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-基-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-喃请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 糖固定在一个动漫阵列上.(A)将氨基尾糖的化学改性为膦酸尾, 通过磷酸酯化学进行共价附着。(B)在糖表面的分布。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: Glyan 阵列分析.(A)合成的N-糖的结构, 在一个动漫阵列上打印。(B) PG9 对单个糖 (左面板) 和糖混合的人5与糖 i-xi (右面板) 与100µM 浓度的混合物进行的绑定分析。在µM 中, PG9 的摩尔浓度在图例中给出。给出了阵列上五独立复制的平均信号强度和标准误差。镶嵌显示荧光图像。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
据报道, 一类 HIV-1 bNAbs, 包括 PG9、PG16 和 PGTs 128, 141-145 在中和 70-80% 循环 HIV-1 分离株中具有极强的效力。这些 bNAbs 的表位是高度保守的变种的整个 HIV-1 组 M, 因此他们可以指导有效的免疫设计的 HIV 疫苗, 以引出中和抗体23,24,25.作为我们正在进行的努力的一部分, 以确定糖表位的 HIV-1 广泛中和抗体, 我们报告了化学和酶合成的高甘露糖, 杂交和复合型低聚糖组成一个糖数组21, 22。然而, 在N-羟基琥珀酰亚胺涂层 (NHS) 玻片上常用的糖阵列无法检测低亲和力的碳水化合物-蛋白质相互作用, 可能是由于水解所产生的异糖分布反应性N-在其表面上 hydroxysuccimide 功能组。为了克服传统阵列格式的局限性, 我们开发了一个糖阵列上的氧化铝涂层玻璃 (动漫) 幻灯片。我们进一步做了一个同质性比较之间的动漫阵列和常用的 NHS 阵列, 以证明该动漫阵列提供了一个更均匀的糖在其表面的显示 22。我们的初步结合分析无法观察到 PG9 对 NHS 阵列的任何糖的约束力 (没有显示数据)。因此, 为了确定 PG9 的结合特异性, 糖 I-XI 被附着在一个膦酸的尾巴上, 并印在100µM 的个人糖 (图 4) 上。通过磷酸酯化学的糖固定化, 提供了一个更稳定和均匀分布。每一个糖打印五复制和幻灯片图像获得了荧光扫描后, DyLight649-conjugated 驴抗人 IgG 抗体孵化。PG9 对单个糖的绑定分析 (图 5, 左面板) 表明 PG9 与混合型糖 (X) 进行了强烈的交互。还检测了高甘露糖型 Man5 (糖 IV) 和复合型糖 (XI) 的相互作用。
由于缺乏共晶结构信息, PG9 与混合型糖 (X) 之间的分子水平相互作用难以确定。混合型糖 X 是由一个复杂类型的手臂组成的 3-o位置的核心和一个 trimannose 臂链接到 6-o位置的中央三。PG9 对杂交糖 X 的结合表明, PG9 需要甘露糖和唾液酸残留物在密切的附近, 以高亲和力的相互作用。为了确定最适合 PG9 结合袋的糖组合, 我们进行了混合糖阵列的研究。糖 IV 是混合与每糖从我 XI 在1:1 摩尔比率和发现在一个动漫阵列。对每种混合物的 PG9 的结合分析表明, 人5和 SCT (iv + xi) 的结合导致了对 PG9 的最高亲和力, 而仅与 iv 或 xi 相比较。此外, 还检测到包含人5和包含 sialylated 触角 (如糖 VIII 和 X) 的混合的混合物, 也有22。这是第一次, 这些结果提供了一个基于阵列的糖的结合行为, PG9 的晶体结构研究提出的 PG9 与 HIV-1 gp120 V1/V2 域23。
最后, 我们已经演示了一种高效的模块化化学-酶的策略, 用于制备在人类糖蛋白上发生的高度不同的N连锁寡糖。此外, 发展一个动漫阵列提供了一种有效的方法来确定极弱的蛋白质-碳水化合物相互作用, 更重要的是, 通过异质糖发生的相互作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢台湾新竹科学园的薄膜技术部、仪器技术研究中心 (增加) 和国家应用研究实验室。这项工作得到了国家科学理事会的支持 (核准号为。最多 105-0210-01-13-01) 和中央研究院。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Clean glass slide | Schott | ||
| Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
| GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
| Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
| P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |
References
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