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Chemistry

Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/55855
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Summary

Un enfoque modular para la síntesis de N- glicanos para enganchar a un vidrio recubierto de óxido de aluminio slide (diapositiva ACG) como un microarray de glicanos se ha desarrollado y ha demostrado su uso para la elaboración de perfiles de un VIH ampliamente neutralizante del anticuerpo.

Abstract

Presentamos una forma muy eficiente para la preparación rápida de una amplia gama de N-ligado oligosacáridos (estimados para exceder 20.000 estructuras) que se encuentran comúnmente en glicoproteínas humanas. Para lograr la deseada diversidad estructural, la estrategia comenzó con la síntesis enzimática de quimioterapia de tres tipos de módulos de fluoruro de oligosaccharyl, seguidos por su progresivo glycosylations selectivo de α en el 3-O y 6O posiciones de la residuos de manosa de la común trisacárido de base tener un vínculo crucial β-manosida. Más lejos atamos los N- glicanos en la superficie de un portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de aluminio (ACG) para crear un conjunto mixto covalente para el análisis de la interacción ligando-hetero con un anticuerpo de VIH. En particular, el comportamiento del enlace de un recién aislados VIH-1 ampliamente anticuerpo de neutralización (bNAb), PG9, a la mezcla de hombre espaciados5GlcNAc2 (Man5) y el complejo bi-antennary 2, 6-di-sialylated tipo N- glicanos (SCT ) en una matriz ACG, se abre una nueva vía para guiar el diseño del inmunógeno eficaz para el desarrollo de vacuna contra el VIH. Además, nuestra gama ACG incorpora una potente herramienta para estudiar otros anticuerpos anti-VIH para el comportamiento hetero-ligando.

Introduction

N- glicanos de las glicoproteínas son covalente a la asparragina (Asn) residuos de la sequon de Asn-Xxx-Ser/Thr de consenso, que afectan varios procesos biológicos tales como el reconocimiento de lectinas, conformación, antigenicidad y solubilidad de proteína 1 , 2. la síntesis química de N-oligosacáridos vinculados representa un desafío sintético importante debido a su enorme heterogeneidad micro estructural y arquitectura muy ramificado. Cuidadosa selección de la protección de grupos para ajustar la reactividad de bloques de construcción, consecución de selectividad en centros de anomérico y uso adecuado de promotor / activator(s) son elementos clave en la síntesis de los oligosacáridos complejos. Para resolver este problema de la complejidad, una gran cantidad de trabajo para avanzar en síntesis de N- glicanos informó recientemente de3,4. A pesar de estos enfoques robustos, encontrar un método eficaz para la preparación de una amplia gama de los N- glicanos (~ 20.000) sigue siendo un gran desafío.

La tasa de mutación rápida del VIH-1 para alcanzar la amplia diversidad genética y su capacidad de neutralizar la respuesta de anticuerpos, es uno de los mayores desafíos para el desarrollo de una vacuna segura y profiláctica contra el VIH-15,6 , 7. una táctica eficaz que VIH utiliza para evitar la respuesta inmune del huésped es la glicosilación poste-de translación de la glicoproteína gp120 con diversos N-ligado glycans derivados desde el host glicosilación maquinaria8, 9. Un reciente informe sobre el análisis preciso de recombinante monomérica HIV-1 gp120 glicosilación de células 293T de riñón embrionario humano (HEK) sugiere la ocurrencia de microheterogeneity estructural con un patrón característico de la célula-específica10 , 11 , 12. por lo tanto, comprensión requiere de las particularidades de glicanos de bNAb de HIV-1 gp120 bien caracterizado relacionadas con N- glycan estructuras en una cantidad suficiente para el análisis.

El descubrimiento de la tecnología de microarrays de glicanos proporciona alto rendimiento-exploración de las especificidades de una amplia gama de proteínas de unión a carbohidratos, bacteriana virus adhesinas, toxinas, anticuerpos y lectines13,14 . El arreglo de glycans sistemática en un formato basado en chip vestido podría determinar interacciones proteína-glicanos de problemática baja afinidad presentación multivalente15,16,17,18. Este arreglo basado en el chip de glicanos convenientemente parece imitar eficazmente interfaces de la célula. Para enriquecer la tecnología y superar la cuestión irregular asociada con formatos de matriz convencional, nuestro grupo recientemente desarrollado una variedad de glicanos en un portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de aluminio (ACG) con glycans terminó de ácido fosfónico para mejorar la intensidad de la señal, homogeneidad y sensibilidad19,20.

Para mejorar la comprensión actual acerca de glicanos epitopos del recién aislados VIH-1 anticuerpos (bNAb) ampliamente neutralizantes, hemos desarrollado una estrategia modular altamente eficiente para la preparación de un amplio arsenal de N-ligado glycans21 ,22 al imprimir en una ACG slide (ver figura 1). Especificidad estudios perfiles de bNAb de VIH-1 en una matriz ACG ofrecen la detección inusual de comportamiento hetero-glicanos del enlace de bNAb altamente potente PG9 que fue aislado del VIH infectados individuos23,24,25.

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Protocol

1. preparación de D1/D2 brazo módulos22

  1. Preparación de intermedio 2
    1. Pesan a partir de material 1 (se muestra en la figura 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) en un tubo de 15 mL y disolver en Tris almacenador intermediario (25 mM, pH 7,5) que contiene Dicloruro de manganeso (MnCl2, 10 m m) para lograr una concentración final de glicanos de 5 mM.
    2. Añadir 2 equivalentes de galactosa de difosfato de uridina (UDP-Gal).
    3. Añadir 150 unidades de la enzima β-1, 4 galactosil transferasas de leche bovina e incubar la mezcla a 37 oC por h 15.
    4. Después de 15 h, realizar la cromatografía en capa fina (TLC) para indicar el consumo total de material de partida por observar la mezcla de reacción sobre una placa de TLC, desarrollando con n-butanol/ácido acético/agua (H2O) en un 1:1:1 relación y coloración por un solución de molibdato de amonio cerio de 0.25 M seguido de calefacción. Luego apagar la reacción por calentamiento en 90 oC durante 5 minutos.
    5. Centrifugar la mezcla de reacción a una velocidad de 2.737 x g durante 3 min y el sobrenadante en la parte superior de la columna de gel de poliacrilamida de la carga (véase Tabla de materiales). Eluir la columna con agua destilada desionizado y recoger el producto con fracciones de 1-2 mL.
    6. Supervisar las fracciones recogidas por TLC26, desarrollando con n-butanol: H2O: ácido acético en 1:1:1 relación y la coloración mediante una solución de molibdato de amonio cerio seguido de calefacción. Liofilizar27 el producto que contiene fracciones para obtener 2 intermedio (115 mg, 86%) como polvo blanco. Caracterizar el producto por NMR28 y29 de la espectrometría de masas (véase el archivo de datos complementarios).
  2. Preparación de intermedio 3
    1. Pesan a partir de material 2 (se muestra en la figura 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0,122 mmol)) en un tubo de 15 mL y disolver en Tris tampón (25 mM, pH 7,5) que contienen MnCl2 (10 mM) para preparar una concentración final de glicanos de 5 mM.
    2. Añadir 2 equivalentes de sal de guanosina disódica 5'-diphospho-β-L-fucosa (PIB-Fuc).
    3. Añadir 150 unidades de la enzima α-1, 3 fucosyl transferasa de píloros de Helicobacter (Hp1-3FTΔ26695) e incubar la mezcla a 37 oC por h 15.
    4. Siga el paso 1.1.4.
    5. Siga el paso 1.1.5.
    6. Siga el paso 1.1.6 para obtener intermedio 3 (82 mg, 84%) como polvo blanco. Caracterizar el producto por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios datos archivo).
  3. Preparación de módulos 4 y 5
    1. Pesar el compuesto 2,-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside p(0,230 g, 0,360 mmol) o compuesto 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,100 g, 0.125 mmol) en un matraz de fondo redondo de 25 mL solo cuello y secado bajo vacío durante 30 minutos.
    2. Quitar el matraz de vacío, relleno con gas nitrógeno, agregar una barra de agitación magnética, tapa con una membrana de goma y coloque un globo de nitrógeno.
    3. Inyecte 7 mL de piridina seca y 3 mL de anhídrido acético (Ac2O) en el matraz a un baño de hielo a 0 oC. Revuelva la reacción resultante de 12 h a temperatura ambiente utilizando un agitador magnético a 600-700 rpm. Se evaporan los disolventes con un rotativo evaporador a una presión de vacío de 0 - 10 mbar a 50 oC.
    4. Diluir la mezcla cruda utilizando 30 mL de diclorometano (DCM) y extraer con Hidrogenocarbonato de sodio acuoso saturado (NaHCO3) (2 x 20 mL) en un matraz de 50 mL.
    5. Vuelva a extraer la capa acuosa con DCM (3 x 15 mL) y secar las capas orgánicas combinadas sobre sulfato de sodio. Quitar el sulfato de sodio por filtración y lavado con DCM (5 mL). Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 400 mbar a 40 oC.
    6. Cargar la solución de la mezcla cruda en 2 mL de DCM en la cima de la cama de sílice.
    7. Eluir la columna con una mezcla que contiene tolueno y la acetona de 0 - 20% acetona en tolueno y recoger fracciones de 5-10 mL.
    8. Supervisar las fracciones recogidas por TLC (pasos 1.1.4 y 1.1.6), desarrollando con acetona/tolueno (7/3), y tinción con una solución de molibdato de amonio cerio seguido por calefacción en un plato caliente.
    9. Evaporar el producto que contiene fracciones utilizando un rotavapor para obtener productos como espuma blanca en 72% y 85% de rendimiento, respectivamente.
    10. Los productos se disuelven en 7 mL de acetonitrilo: tolueno: H2O en 4: proporción de 2:1 en un matraz de fondo redondo de 25 mL.
    11. Agregar nitrato de amonio cerio (2 equivalentes) mientras se enfría a 0 oC utilizando un baño de hielo. Revuelva la reacción a temperatura ambiente durante 3 h a ~ 500-800 rpm.
    12. Después de TLC indica el consumo total de material de partida (TLC con acetona/tolueno (7/3) y visualizar por absorbancia UV a 254 nm o por tinción con una solución de molibdato de amonio cerio seguido de calefacción), diluir la mezcla de reacción con acetato de etilo (30 mL) y extracto de H2O (15 x 2 mL).
    13. Extrae las capas orgánicas combinadas con 5 mL de solución saturada cloruro de sodio (NaCl).
    14. Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 240 mbar a 40 oC.
    15. Cargar la solución de producto crudo en 2 mL de DCM en la cima de la cama de sílice. Eluir la columna con una mezcla que contiene tolueno y la acetona (0 - 20% acetona en tolueno) y recoger fracciones de 5-10 mL. Supervisar las fracciones recogidas por el TLC, desarrollando con acetona/tolueno (7/3).
    16. Evaporar las fracciones que contienen el producto usando un evaporador rotatorio a 77 mbar vacío y 40 oC para obtener productos como espumas blancas.
    17. Los respectivos alcoholes se disuelven en 10 mL de DCM en un matraz de fondo redondo cuello solo 25 mL y enfriar a-30 oC.
    18. Añadir trifluoruro de diethylaminosulfur (DAST, 2 equivalentes). Revuelva la mezcla de reacción a-30 oC por 2 h.
    19. Después de TLC indica consumo de material de partida (TLC con acetona/tolueno (4/1) y visualizar por absorbancia UV a 254 nm o por tinción con una solución de molibdato de amonio cerio seguido de calefacción), diluir la mezcla de reacción con DCM (30 mL) , y lavado con saturado NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. Extraer la capa orgánica combinada con 5 mL de solución saturada de NaCl, secarlo agregando sulfato de magnesio anhidro, filtrar la mezcla después de un lavado con DCM (5 mL) y recoger en un matraz de fondo redondo de 100 mL cuello solo.
    21. Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 400 mbar a 40 oC.
    22. Cargar la solución de producto crudo en 2 mL de DCM en la cima de la cama de sílice. Eluir la columna con una mezcla de tolueno y acetona (0-20% acetona en tolueno) y recogemos fracciones de 5-10 mL.
    23. Supervisar las fracciones recogidas por el TLC, desarrollando con acetona/tolueno (7/3).
    24. Evaporar el producto que contiene fracciones utilizando un rotavapor para obtener productos deseados 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluoruro (54% en 2 pasos) y 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluoruro (67% en 2 pasos) como sólidos blancos.
    25. Caracterizar el producto por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios datos archivo).

2. preparación de glicanos 10

  1. Preparación de intermedio 7
    1. Peso plata triflate dicloruro de bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) (AgOTf) (0,039 g, 0.155 mmol) (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0.108 mmol) en un matraz de fondo redondo de 25 mL cuello solo, secado a vacío de línea de schlenk para 30 minutos, quitarlo de la vacío y llenarlo con gas nitrógeno.
    2. Transferir los recién secado 4 Å tamices moleculares (0,2 g) en el matraz que contiene el AgOTf y Cp2HfCl2, agregar una barra de agitación magnética, inmediatamente la tapa con el tabique y añadir un globo de nitrógeno.
    3. Transferencia de tolueno seco 3 mL en el matraz con una jeringuilla de cristal seco. Revuelva la mezcla de reacción durante 1 hora a temperatura ambiente y luego enfriar a 0 oC.
    4. Inyectar una solución de donantes 4 (figura 2, 0,043 g, 0.046 mmol) y aceptador 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (figura 3, 0,045 g, 0.031 mmol) en tolueno 3 mL en el matraz a través del tabique utilizando una jeringa de 10 mL 0 o C. Revuelva la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 3 horas.
    5. Después de TLC indica consumo de materias primas (TLC, desarrollando con DCM/acetona (8.5/1.5) y visualizar por absorbancia UV a 254 nm o por tinción con una solución de molibdato de amonio cerio seguido de calefacción), calmar la reacción por inyección de 10 equivalentes de trietilo amina.
    6. Los tamices moleculares a través de un lecho de celite del filtro en un matraz de fondo redondo de 50 mL y lavar con 10 mL de acetato de etilo más. Extrae las capas orgánicas combinadas con una solución saturada acuosa de NaHCO3 (2 x 20 mL) en un matraz de 50 mL. Extraer la capa acuosa con acetato de etilo (3 x 15 mL).
    7. Las capas orgánicas combinadas con solución saturada de NaCl (5 mL) del extracto seco mediante el uso de sulfato de magnesio anhidro, filtrar la mezcla para eliminar el sulfato de magnesio, lavar con acetato de etilo (3 x 15 mL) y recoger el filtrado en un matraz de fondo redondo de 100 mL.
    8. Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 240 mbar a 40 oC.
    9. Cargar la solución de producto crudo en DCM en la cima de la columna de la cama de sílice. Eluir la columna con una mezcla que contiene DCM y acetona (0-10% acetona en DCM) y recoger fracciones de 5-10 mL.
    10. Seguimiento de las fracciones recogidas por el TLC, desarrollando con DCM/acetona (8.5/1.5). Evaporar las fracciones que contiene el producto utilizando un rotavapor para obtener [5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 7, intermedio 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0,052 g, 70%), como espuma blanca.
    11. Caracterizar el producto por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios datos archivo).
  2. Preparación de intermedio 8
    1. Pesar hexasaccharide 7 (figura 3, 0,040 g, 0.016 mmol) en un matraz de fondo redondo de 25 mL cuello solo secado bajo vacío para 1 h, quitar de vacío, relleno con gas nitrógeno, agregar una barra de agitación magnética y tapa con una membrana de goma.
    2. Transferencia de 3 mL de acetonitrile:methanol (MeOH) (proporción 2:1) en el matraz.
    3. Añadir p-monohidrato de ácido sulfónico de tolueno (0,001 g, 0.008 mmol) en el matraz de reacción y revuelva la reacción a 800 rpm durante 5 h.
    4. Después de TLC indica consumo de material de partida (TLC, desarrollando con DCM/acetona (8.5/1.5) y visualizar por absorbancia UV a 254 nm o por tinción con una solución de molibdato de amonio cerio seguido de calefacción), calmar la reacción por inyección de 10 equivalentes de trietilo amina.
    5. Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 337 mbar a 40 oC.
    6. Disolver la mezcla cruda de aproximadamente 2 mL de DCM y carga encima de la cama de sílice.
    7. Eluir la columna con una mezcla de DCM y acetona (0 - 10% de acetona en DCM) y recogemos fracciones de 5-10 mL. Seguimiento de las fracciones recogidas por el TLC, desarrollando con DCM/acetona (8.5/1.5). Evaporar el solvente usando un evaporador rotatorio a 400 mbar vacío y 40 oC.
    8. Secar el residuo a presión reducida para dar intermedio 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-acetil-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3, 6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Figura 3, 0,022 g, 57%) como un sólido blanco. Caracterizar el producto por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios datos archivo).
  3. Preparación de intermedio 9
    1. Preparación de intermedio 9 (figura 3) se logró utilizando donantes 5 (0,015 g, 13.2 μmol) y aceptador 8 (figura 3, 0,020 g, 8.80 μmol).
    2. AgOTf (0,011 g, 44,1 μmol) y Cp2HfCl2 (0,012 g, 30,8 μmol) fueron utilizados como un promotor.
    3. Realice los pasos 2.1.1 al 2.1.10 para intermedios 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as espuma blanca.
  4. Global desprotección de intermedio
    1. Pesar compuesto 9 (0,010 g, 2,9 μmol) en un matraz de fondo redondo de 25 mL cuello solo, agregar una barra de agitación magnética, tapa con una membrana de goma y conecte un globo de nitrógeno.
    2. Transferir 2 mL de 1, 4 dioxano: H2O (4:1) en el matraz. Añadir hidróxido de litio (LiOH) (0,005 g, 50% por peso) en el matraz. Revuelva la mezcla de reacción a 90-100 oC por 12 h y deje que se enfríe a TA.
    3. Se evaporan los disolventes utilizando un evaporador rotatorio seco el matraz vacío de 1 h, llenar con nitrógeno, retírelo de la Unidad succionadora y tapa con una membrana de goma.
    4. Inyectar 4 mL de piridina seca y 2 mL de anhídrido acético en el matraz a través del tabique mediante una jeringa de 10 mL a 0 oC. Revuelva la mezcla de reacción de 12 h a TA.
    5. Se evaporan los disolventes utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 0-10 mbar a 50 oC.
    6. Disolver la mezcla cruda utilizando 30 mL de DCM y extraer la solución saturada acuosa NaHCO3 (2 x 20 mL) en un matraz de 50 mL.
    7. Vuelva a extraer la capa acuosa con DCM (3 x 15 mL). Evaporar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio.
    8. Cargar una solución de producto en 2 mL aproximadamente de DCM en la cima de la cama de sílica C18. Eluir la columna con una mezcla de agua y metanol (0 - 100% de metanol en agua) y recoger fracciones de 5-10 mL.
    9. Recoger las fracciones de producto y se evaporan a presión reducida para obtener el producto deseado como espuma blanca.
    10. Disolver el producto en 5 mL de metanol seco de 25 mL redondo matraz de fondo y la tapa con una membrana de goma.
    11. Transferir 0,1 mL de Metóxido sódico (NaOMe) en metanol y fresco a 0 oC utilizando un baño de hielo y revolver la mezcla durante 12 horas.
    12. Quite el solvente usando un evaporador rotatorio y secar el producto en alto vacío.
    13. Disolver los productos crudos en 5 mL de metanol: H2O: ácido acético (6:3:1).
    14. Añadir hidróxido de paladio (Pd(OH)2) (50% por peso) y la reacción en atmósfera de hidrógeno usando un globo de hidrógeno de 15 h.
    15. La reacción a través de un lecho de celite del filtro y lavar con 2 mL de metanol, seguido de 2 mL de agua dd.
    16. Se evaporan los disolventes utilizando un evaporador rotatorio.
    17. Disolver la mezcla de crudo con aproximadamente 1 mL de agua y colóquela encima de la cama de gel de poliacrilamida (véase Tabla de materiales). Eluir el producto con agua y recoger fracciones de 1-2 mL.
    18. Supervisar las fracciones recogidas por el TLC, desarrollar con n-butanol: H2O: ácido acético (1:1:1).
    19. Recoger las fracciones de producto y liofilizar para obtener el producto deseado (5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-) 10, α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a polvo blanco.
    20. Caracterizar el producto por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios datos archivo).

3. preparación de glicanos con cola ácido fosfónico19,22

  1. Pesar los glicanos respectivos (2-5 μmol) en un matraz de fondo redondo 5 mL, agregar una barra de agitación magnética y tapa con una membrana de goma.
  2. Transfiera 400 μL de dimetilformamida recién secado.
  3. Añadir [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) fosforilo) ethoxyethoxy) carbonato de etilo (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl)] (10-25 μmol, preparado en casa) a la solución de glicanos. Revolver la mezcla a 800 rpm durante 5 h.
  4. Se evaporan los disolventes utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 5-10 mbar a 40 oC.
  5. Disolver la mezcla de reacción en 0,5 mL de agua y de la carga en la parte superior de la cama de gel de poliacrilamida (véase Tabla de materiales). Eluir el producto con agua y recoger fracciones de 1-2 mL.
  6. Supervisar las fracciones recogidas por TLC26. Spot de la mezcla de reacción sobre una placa de TLC y agregar colorante solución de molibdato de amonio cerio de 0.25 M; siga calentando con una placa caliente. Recoger el producto que contiene fracciones y liofilizar para obtener el producto deseado como un polvo blanco.
  7. Disolver el producto en 2 mL de agua y añadir Pd (OH)2 (50% en peso). Revuelva la reacción a 800 rpm en atmósfera de hidrógeno usando un globo de hidrógeno de 15 h.
  8. La reacción a través de un lecho calcinado flujo del filtro y lavar con 2 mL de metanol, seguido de 2 mL de agua destilada desionizado. Se evaporan los disolventes utilizando un evaporador rotatorio a presión vacío de 300 mbar a 40 oC.
  9. Disolver la mezcla de crudo con aproximadamente 1 mL de agua y colóquela encima de la cama de gel de poliacrilamida (véase Tabla de materiales).
  10. Eluir el producto con agua y recoger fracciones de 1-2 mL. Supervisar las fracciones recogidas por TLC26. Liofilizar las fracciones (congelar el producto con nitrógeno líquido, luego coloque en liofilizador bajo un vacío) para obtener el producto deseado como un polvo blanco. Caracterizar los productos por RMN y espectroscopia de masas (ver complementarios archivo de datos) utilizando D2O como solvente.

4. glicanos matriz

  1. Preparación de aluminio revestido vidrio diapositivas (slide ACG) 19 , 20 , 22
    Nota: Fabricación de los portaobjetos de vidrio recubierto de aluminio se realizó en la división de tecnología de película delgada, centro de investigación de tecnología de instrumento y nacional laboratorios de investigación aplicada, parque científico de Hsinchu, Taiwán.
    1. Paquete portaobjetos recubiertos, sello de vacío para evitar la formación de la NAO y mantenga sellado hasta que la reacción electroquímica de anodizado superficial.
  2. Superficie anodización de aluminio revestido de laminas de vidrio 19 , 20 , 22
    1. Establecer la incubadora con control de temperatura a 4 ° C. Preparar solución acuosa de ácido oxálico de 0,3 M y mantener en un baño de hielo. Tome el vaso de precipitados de 500 mL, añada una barra agitadora por imán.
    2. Transferir el ácido oxálico de 0,3 M, vaso de precipitados de 500 mL y luego coloque una varilla de 10 cm de largo platino como un cátodo en la solución. Mantener revolviendo (a 300 rpm) el ácido oxálico en todo el proceso de anodización.
    3. Activar software tracer de lab, haga clic en el botón "configuración" luego "función voltaje de barrido de elección". Establecer el inicio y parada voltaje a 25,8 V, número de puntos a 100, cumplimiento a 1 y barrido retraso de ms de 1.200 y haga clic en "Aceptar".
    4. Abrazadera de la parte de vidrio recubierto de aluminio hacia el cátodo. Haga clic en el botón "test run". Observar la medición actual (~ 8-10 mA).
    5. Después de la anodización superficial, lavar el portaobjetos con agua destilada doble purga con nitrógeno seco y luego almacenar en una cámara de humedad relativa de 30% hasta su uso posterior.
  3. Fabricación de ACG glycan microarray 22
    1. Preparar 100 μl de los glicanos monovalentes (I-XI) etilen glicol en concentración 10 mM individualmente.
    2. Diluir los glicanos arriba con tampón de impresión (80% glicol de etileno y el 20% de agua desionizado) para hacer 100 concentración μm.
    3. Para estudio de hetero-ligando, prepare 5 μl de cada XI glycans y a cada uno añadir 5 μl del hombre5GlcNAc2 (proporción 1:1).
    4. Microarrays impresos de robótica del perno (véase Tabla de materiales) por la deposición de 0,6 nL de los glicanos previamente preparados en ACG diapositivas31.
    5. Almacenar las diapositivas impresas en una caja seca de humedad controladas antes de la prueba enlace.
  4. Mapeo de epítopos de glicanos de HIV-1 anticuerpos ampliamente neutralizantes PG9 22
    1. Preparar 1 mL de BSA contenida tampón de SAFT, 3% peso/volumen.
    2. Preparar 70 μl de PG9 (50 μg/mL) en tampón de SAFT (BSA contenía tampón de SAFT, 3% w/v).
    3. Preparar 120 μl del anticuerpo secundario etiqueta fluorescente burro anti humano IgG (Alexa Fluor 647 conjugado) 50 μg/mL en tampón de SAFT (BSA contenía tampón de SAFT, 3% w/v) en la oscuridad.
    4. Mezcla principal (PG9) y el anticuerpo secundario etiqueta fluorescente en proporción 1:1 (60 μL cada una). Incubar premezclados anticuerpos durante 30 min a 4 ° C.
    5. Cargar la diapositiva ACG en la cámara de incubación de la diapositiva que se divide en 16 pozos. Transferir 100 μl de anticuerpos premezclados a la matriz de glicanos e incubar a 4 ° C por 16 h.
    6. Pipeta de un premezclado anticuerpos. Extraiga la cámara de incubación de la diapositiva.
    7. Lavar el portaobjetos primero en tampón de SAFT (PBS y 0.05% Tween-20), seguido por agua desionizada y vuelta seco a 2.000 x g.
    8. Abra el software de análisis de imagen de microarrays (véase Tabla de materiales). Insertar una diapositiva con las características vestidas hacia abajo.
    9. Haga clic en el menú "configuración", ajuste la resolución de imagen 5 μm por píxel y la longitud de onda de 635 nm PMT450 y energía al 100%.
    10. Haga clic en el botón "scan" para empezar la diapositiva de imagen.
    11. Haga clic en el icono de "archivo" para guardar la imagen de escaneo en formato tif.
    12. Realizar análisis de imagen siguiendo de guía del usuario del software32.
    13. Calcular la intensidad total de fluorescencia e ilustrar usando software33 de procesamiento de imágenes (véase Tabla de materiales).
      Nota: Aquí, el porcentaje promedio de errores para todos los puntos de datos se presenta por las barras de error.

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Representative Results

Una estrategia modular de chemo-enzimática para la síntesis de una amplia gama de los N -glicanos se presenta en la figura 1. La estrategia está basado en el hecho de que la diversidad puede crearse en principio por la quimio-enzimático síntesis de los tres módulos importantes, seguido por el mannosylation de α-específicas en el 3-O o 6O posición de los residuos de manosa de la común trisacárido de N- glicanos de la base. Teniendo en cuenta la diversidad estructural de bi-, tri- y tetra-antennary complejos tipo N- glycan estructuras, creímos que un conjunto de donantes de oligosaccharyl y el aceptador de trisacáridos de núcleo con alkyl preinstalado handlecould utilizarse como a partir materiales para generar la diversidad estructural deseada (figura 1). Se ha demostrado la aplicabilidad de glicosil donantes de fluoruro en la construcción de una biblioteca de glicanos complejo previamente21.

Para demostrar la efectividad de nuestra estrategia, una estructura isomérica bi-antennary (10, figura 3) fue seleccionada para síntesis. El D1 brazo antenas 4 y D2 brazo antenas 5 de glicanos 10 se generaron en gran escala por métodos enzimáticos de chemo. En particular, el disacárido aceptador 1 enzimático fue galactosylated mediante el uso de β-1, 4-galactosyltransferase y uridina 5'-diphosphogalactose (UDP-Gal) para formar el trisacárido 2. A continuación, la intermedia 2 fue fucosylated en posición de GlcNAc 3 -O en presencia de α-1, 3-fucosyltransferase de Helicobacter pylori (Hpα1, 3 pies) para permitir el tetrasacárido deseada 3. Ligadura química a base, bloques 2 y 3 fueron peracetylated primera, y el reducción final pmetoxi - fenol grupo fue eliminado. Finalmente, se instaló el fluoruro en presencia de DAST para conseguir la deseada módulos 4 y 5, respectivamente (figura 2).

Tener a mano los módulos deseados, a continuación procedemos a la glicosilación de estereoselectiva 3 -O 4 a la base trisacárido 6 bajo catálisis de plata triflate y dicloruro de hafnocene para proporcionar el respectivo hexasaccharide 7 (Figura 3). La protección de Bencilideno que enmascarar 4, 6-OH fue quitado usando catalizador p-ácido sulfónico de tolueno (p- TSA). Aprovechando su reactividad, primaria 6-OH de 8 fue reaccionado con fluoruro módulo 5 bajo similares condiciones experimentales para lograr la necesaria decasaccharide 9. Por último, desprotección global fue realizada para obtener glycan 10, que se caracteriza mediante RMN y espectroscopia de masas (véase el archivo de datos complementarios).

Glicanos que contienen una cola de pentilo amina al final reducción fueron modificadas con enlazadores de ácido fosfónicos y Unidos a la superficie ACG a través de fosfonato química (figura 4). En bNAb pasado, VIH-1 PG9 fue defendido por su especificidad de glicanos con arreglos de discos de homo - y hetero-glicanos para demostrar por primera vez que PG9 interactuaban con heteroglycans adyacentes en el loop de V1/V2 de gp120 de HIV-1 superficie (figura 5).

Figure 1
Figura 1: Estrategia general de modular para la preparación de N- glycans. (A) el número de N- glycans generados por esta estrategia que ocurren comúnmente en glicoproteínas humanas se estima para superar los 20.000. (B) tres tipos de módulos preparados por este enfoque quimio-enzimático que puede utilizarse para α-seletive glycosylations. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: síntesis de Chemoenzymatic de módulos de. i, UDP-Galactosa, β 1, 4-GalT, 15 h, 86%; ii, PIB-fucosa, α 1, 3-FucT, 15 h, 84%; III, (1) CA2O, piridina, RT, 12 h; (1) puede, ACN: tolueno: H2O, (3) DAST, CH2Cl2,-30 oC. puede: Cerio nitrato de amonio; DAST: Trifluoruro de Diethylaminosulfur.
Nomenclatura de producto: 1, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopiranosil-(1→ 2)-α-D-mannopyranoside; 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside; 3, p-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside - Metoxifenil; 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluoruro; 5, [Fluoruro fucopyranosyl(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl 2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L- haga clic aquí para ver un una versión ampliada de esta figura.

Figure 3
Figura 3: química glicosilación de los módulos D1/D2 Brazo aceptor de la base. , 4, AgOTf, Cp2HfCl2, tolueno, 4 Å MS, 0 oC a RT, 70%; ii, p- TSA, acetonitrilo, RT, 57%; III, 5, AgOTf, Cp2HfCl2, tolueno, 4 Å MS, 0 oC a RT, 34%; iv, (1) LiOH, 1, 4-dioxano: H2O; 90 oC, 12 h; (2) CA2O, piridina, 12 h; (3) NaOMe, MeOH, 12 h; (4) Pd(OH)2, MeOH: H2O: HCOOH (5:3:2), H2, 36%. AgOTf: Trifluromethanesulfonate de plata; CP2HfCl2: dicloruro de hafnio Bis (cyclopentadienyl), MS: tamices moleculares, nomenclatura de los productos: 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2- acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-Acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosid. 8, 5-Azidopentyl - O-(2-O-acetil-3.4.6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside. 9, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-{2,3,4,6- O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-( 1→4)-O-(3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-Dglucopyranoside 10, 5- Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)(α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)- Α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: inmovilización de glicanos en una matriz ACG. (A) modificación química de glicanos con cola amino a un ácido fosfórico de la cola para el accesorio covalente a la diapositiva ACG a través de la química de fosfonato. (B) distribución de glycans en una superficie ACG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis de matriz Glyan. Estructuras (A) de N- glicanos sintéticos que están impresas en una matriz ACG. (B) enlace análisis de PG9 glycans individual me-XI imprimir en matriz ACG (panel izquierdo) y mezclas de glicanos de hombre5 mezclado con glycans-XI (panel derecho) con concentración μm 100. Las concentraciones molares en μm para PG9 figuran en la leyenda. Se muestran las intensidades de la señal media y error estándar calculado para cinco repeticiones independientes en la matriz. Apliques de mostrar imágenes de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Una clase de bNAb de VIH-1 incluyendo PG9, PG16 y PGTs 128, 141-145 reportaron ser muy potente en la neutralización de 70-80% de los aislados de VIH-1 que circulan. Los epitopos de los bNAb están muy conservados entre las variantes de todo el grupo de VIH-1 M, por lo tanto puede orientar el diseño del inmunógeno eficaz para una vacuna contra el VIH generar anticuerpos neutralizantes23,24,25 . Como parte de nuestros continuos esfuerzos para identificar los epitopos de glicanos del VIH-1 anticuerpos ampliamente neutralizantes, reportamos la síntesis química y enzimática de un panel de alta manosa, híbrido y oligosacáridos del tipo complejo para formar una matriz de glicanos21, 22. Sin embargo, las matrices de glicanos utilizados en N- hydroxysuccinimide revestido (NHS) portaobjetos son incapaces de detectar las interacciones de los carbohidratos y proteínas de baja afinidad, probablemente debido a la distribución heterogénea de glicanos resultantes de la hidrólisis de reactivo N- hydroxysuccimide funcionales grupos en su superficie. Para superar las limitaciones de la matriz convencional formatos, hemos desarrollado una variedad de glicanos en una diapositiva de (ACG) de vidrio recubierto de óxido de aluminio. Además realizamos una comparación de la homogeneidad entre la matriz ACG y el NHS utilizado matriz para probar que la matriz ACG ofrece una presentación de glicanos más homogénea en su superficie22. Nuestro análisis preliminar vinculante no pudo observar la Unión de PG9 a cualquiera de los glicanos en arreglo de discos de NHS (datos no mostrados). Por lo tanto, para definir la especificidad del atascamiento de PG9, glicanos-XI unida a una cola de ácido fosfónico e impreso en la diapositiva de la ACG con 100 μm de glycans individuales (figura 4). La inmovilización de glicanos en una diapositiva ACG a través de fosfonato química ofrece una distribución más homogénea y estable. Cada uno de los glicanos fue impresa con cinco repeticiones y se obtuvieron imágenes de diapositiva de una exploración de fluorescencia después de la incubación de burro DyLight649 conjugado anti humano IgG anticuerpo. El análisis de enlace de PG9 hacia glycans individual impresa en array ACG (figura 5, panel de la izquierda) sugiere que PG9 interactuaba fuertemente con glicanos tipo híbrido (X). También se detectaron las interacciones de tipo de alta manosa Man5 (glicanos IV) y los glicanos de tipo complejo (XI).

Las interacciones moleculares de nivel entre glycan PG9 y tipo híbrido (X) son difíciles de determinar debido a la falta de la información de la estructura de cristal Co. Los glicanos tipo híbrido X se compone de un brazo de tipo complejo en el 3-O posición de la base y un brazo de trimannose vinculados a la 6-O posición del trisacárido central. Unión de PG9 a glicanos híbrido X sugiere que PG9 requiere residuos de manosa y ácido siálico en las cercanías de las interacciones de alta afinidad. Para identificar la combinación de glicanos que mejor cabe en el bolsillo de Unión PG9, realizamos un estudio de matriz mixta-glicanos. Glycan IV se mezcló con cada glycan de XI en un ratio molar de 1:1 y visto en una matriz ACG. El análisis de enlace de PG9 a cada una de las mezclas indicó que una combinación de hombre5 y un SCT (IV + XI) dio lugar a la mayor afinidad hacia PG9 comparado IV u XI solamente. Además, las mezclas que contengan hombre5 y aquellos que contienen antenas sialylated como glycans VIII y X fueron también detectan22. Por primera vez, estos resultados ofrecen una prueba de la matriz base para el comportamiento del enlace hetero-glicanos de PG9 que fue sugerida por estudios de la estructura del cristal de PG9 con de dominio de V1/V2 de gp120 de HIV-123.

En conclusión, hemos demostrado una estrategia eficiente de chemo-enzimáticos modular para la elaboración de muy diversos N-ligados de oligosacáridos que se producen en glicoproteínas humanas. Además, el desarrollo de una matriz ACG proporciona que un medio eficaz determinar las interacciones de proteínas-hidratos de carbono extremadamente débil y, más importantemente, las interacciones que se producen a través de hetero-glicanos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a la división de tecnología de película delgada, centro de investigación de tecnología de instrumento (ITRC) y nacional laboratorios de investigación aplicada, parque científico de Hsinchu, Taiwán. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de ciencia (no de la concesión. La mayoría 105-0210-01-13-01) y Academia Sinica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Química número 132 quimio-enzimático síntesis ACG glicanos los arreglos de discos VIH neutralizando anticuerpos N- glycans perfil enfoque modular de la especificidad
Chemo-enzimático síntesis de <em>N</em>- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles
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Shivatare, S. S., Shivatare, V. S.,… More

Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C. Y., Wong, C. H. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).

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