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Chemistry

Chemo-एंजाइमी का संश्लेषण एन-glycans के लिए सरणी विकास और एचआईवी एंटीबॉडी profile

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/55855
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Summary

एक glycan microarray के रूप में एक एल्यूमीनियम ऑक्साइड लेपित ग्लास स्लाइड (ACG स्लाइड) के लिए अनुलग्नक के लिए एनglycans के संश्लेषण के लिए एक मॉड्यूलर दृष्टिकोण विकसित किया गया है और एक एचआईवी के लिए व्यापक रूप से बेअसर एंटीबॉडी की रूपरेखा के लिए इसके उपयोग का प्रदर्शन किया गया है ।

Abstract

हम N-लिंक्ड oligosaccharides की एक विस्तृत श्रृंखला की तीव्र तैयारी के लिए एक अत्यधिक कुशल तरीका प्रस्तुत करते है (२०,००० संरचनाओं को पार करने का अनुमान) जो कि सामांयतः मानव नच पर पाए जाते हैं । वांछित संरचनात्मक विविधता को प्राप्त करने के लिए, रणनीति oligosaccharyl फ्लोराइड मॉड्यूल के तीन प्रकार के chemo-एंजाइमी संश्लेषण के साथ शुरू हुआ, के बाद उनके stepwise α-चयनात्मक glycosylations के 3-ओ और 6-ओ पदों पर एक महत्वपूर्ण β-mannoside लिंकेज होने trisaccharide आम कोर के mannose अवशेष । हम आगे एक एल्यूमीनियम ऑक्साइड लेपित ग्लास (ACG) स्लाइड की सतह के लिए N-glycans एक एचआईवी ligand के साथ hetero-एंटीबॉडी बातचीत के विश्लेषण के लिए एक आबंध मिश्रित सरणी बनाने के लिए संलग्न । विशेष रूप से, एक नए अलग एचआईवी के बंधन व्यवहार-1 मोटे तौर पर बेअसर एंटीबॉडी (bNAb), PG9, बारीकी से अंतरिक्ष आदमी के मिश्रण करने के लिए5GlcNAc2 (आदमी5) और 2, 6-di-sialylated द्वि-एंटेना जटिल प्रकार N-glycan (SCT ) एक ACG सरणी पर, एक नया अवसर एचआईवी वैक्सीन विकास के लिए प्रभावी immunogen डिजाइन गाइड खोलता है । इसके अलावा, हमारे ACG सरणी hetero-ligand बाध्यकारी व्यवहार के लिए अंय एचआईवी एंटीबॉडी अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतीक हैं ।

Introduction

N-glycans पर नच asparagine (Asn) आम सहमति के अवशेषों से जुड़े covalently है Asn-Xxx-Ser/sequon, जो प्रोटीन अनुरूपता, antigenicity, घुलनशीलता, और लेक्टिन मांयता के रूप में कई जैविक प्रक्रियाओं को प्रभावित 1 , 2. N-लिंक्ड oligosaccharides के रासायनिक संश्लेषण क्योंकि उनके विशाल संरचनात्मक सूक्ष्म विविधता और उच्च शाखाओं में बंटी वास्तुकला का एक महत्वपूर्ण सिंथेटिक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है । समूहों की रक्षा करने के लिए इमारत ब्लॉकों, anomeric केंद्रों पर selectivity को प्राप्त करने की धुन के लिए सावधान चयन, और प्रमोटर के समुचित उपयोग/उत्प्रेरक (ओं) जटिल oligosaccharides के संश्लेषण में प्रमुख तत्व हैं । जटिलता की इस समस्या को हल करने के लिए, काम की एक बड़ी राशि के लिए अग्रिम N-glycan संश्लेषण हाल ही में बताया गया था3,4. इन मजबूत दृष्टिकोण के बावजूद, N-glycans (~ २०,०००) की एक विस्तृत श्रृंखला की तैयारी के लिए एक प्रभावी तरीका ढूंढना एक बड़ी चुनौती बनी हुई है ।

एचआईवी के तेजी से उत्परिवर्तन दर-1 व्यापक आनुवंशिक विविधता और अपनी एंटीबॉडी प्रतिक्रिया को बेअसर करने से बचने की क्षमता को प्राप्त करने के लिए, सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक एचआईवी के खिलाफ सुरक्षित और नियत्रंण वैक्सीन विकसित-15,6 , 7. एक प्रभावी तरीका है कि एचआईवी के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने का उपयोग करता है के बाद एक विविध Nसे जुड़े glycans मेजबान ग्लाइकोसिलेशन मशीनरी से व्युत्पंन के साथ ग्लाइकोप्रोटीन gp120 के बाद अनुवाद ग्लाइकोसिलेशन है8, 9. मानव भ्रूण गुर्दा (HEK) 293T कोशिकाओं से संयोजक monomeric एचआईवी-1 gp120 ग्लाइकोसिलेशन के सटीक विश्लेषण के बारे में हाल ही की एक रिपोर्ट एक विशिष्ट कोशिका विशेष पैटर्न के साथ संरचनात्मक microheterogeneity की घटना का पता चलता है10 , 11 , 12. इसलिए, एचआईवी के glycan विशिष्टताओं को समझने-1 bNAbs विश्लेषण के लिए पर्याप्त मात्रा में अच्छी तरह से विशेषता gp120 संबंधित एनglycan संरचनाओं की आवश्यकता है ।

glycan microarray प्रौद्योगिकी की खोज कार्बोहाइड्रेट-बंधन प्रोटीन की एक विविध रेंज के विशिष्टताओं के उच्च प्रवाह आधारित अन्वेषण प्रदान की, वायरस/बैक्टीरियल adhesins, विषाक्त पदार्थों, एंटीबॉडी, और lectines13,14 . एक सरणी चिप-आधारित स्वरूप में व्यवस्थित glycans व्यवस्था समस्याग्रस्त कम अपनत्व प्रोटीन-glycan इंटरैक्शन को multivalent प्रस्तुति के माध्यम से निर्धारित कर सकती है15,16,17,18. यह चिप आधारित glycan व्यवस्था आसानी से सेल सेल इंटरफेस को प्रभावी ढंग से नकल करने के लिए प्रकट होता है । प्रौद्योगिकी को समृद्ध और असमान पारंपरिक सरणी प्रारूपों के साथ जुड़े मुद्दे पर काबू पाने के लिए, हमारे समूह ने हाल ही में एक एल्यूमीनियम ऑक्साइड लेपित ग्लास (ACG) स्लाइड पर एक glycan सरणी विकसित phosphonic एसिड का उपयोग कर glycans को समाप्त करने के संकेत तीव्रता बढ़ाने के लिए, एकरूपता, और संवेदनशीलता19,20।

नए अलग एचआईवी के glycan epitopes के बारे में वर्तमान समझ में सुधार करने के लिए-1 मोटे तौर पर बेअसर एंटीबॉडी (bNAbs), हम N-जुड़े glycans21 की एक व्यापक सरणी की तैयारी के लिए एक अत्यधिक कुशल मॉड्यूलर रणनीति विकसित की है ,22 एक ACG स्लाइड पर मुद्रित करने के लिए ( चित्र 1) देखें । एक ACG सरणी पर एचआईवी-1 bNAbs के विशिष्टता की रूपरेखा अध्ययन अत्यधिक शक्तिशाली bNAb PG9 कि एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों23,24,25से अलग किया गया था की hetero-glycan बाध्यकारी व्यवहार का असामांय पता लगाने की पेशकश की ।

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Protocol

1. D1/D2 एआरएम मॉड्यूल की तैयारी22

  1. मध्यवर्ती 2 की तैयारी
    1. वजन शुरू सामग्री 1 ( चित्रा 2में दिखाया गया है, पी-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl-(1 → 2)-α-d-mannopyranoside (१०० मिलीग्राम, ०.२०४ mmol)) में एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और भंग में Tris बफर (25 मिमी, पीएच ७.५) युक्त मैंगनीज dichloride (MnCl2, 10 मिमी) 5 मिमी का अंतिम glycan एकाग्रता प्राप्त करने के लिए.
    2. uridine diphosphate गैलेक्टोज (UDP-Gal) के 2 समकक्ष जोड़ें ।
    3. जोड़ें १५० एंजाइम β-1, 4 गोजातीय दूध से galactosyl transferases की इकाइयों, और 15 एच के लिए ३७ ओसी पर मिश्रण मशीन ।
    4. 15 एच के बाद, पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) एक टीएलसी प्लेट पर प्रतिक्रिया मिश्रण खोलना द्वारा सामग्री शुरू करने की कुल खपत का संकेत करने के लिए प्रदर्शन, n-ब्यूटानॉल/एसिटिक एसिड/पानी (एच2ओ) के साथ विकसित करने में एक 1:1:1 अनुपात और दाग से एक ०.२५ मीटर सीरियम अमोनियम molybdate का समाधान हीटिंग के बाद । तो 5 मिनट के लिए ९० ओसी पर हीटिंग द्वारा प्रतिक्रिया बुझाने ।
    5. 3 मिनट के लिए २,७३७ x g की गति से प्रतिक्रिया मिश्रण केंद्रापसारक, और polyacrylamide जेल कॉलम के शीर्ष पर supernatant लोड ( सामग्री की तालिकादेखें) । आसुत de-Elute पानी का उपयोग कर कॉलम, और 1-2 मिलीलीटर के अंश के साथ उत्पाद इकट्ठा ।
    6. 26टीएलसी द्वारा एकत्र अंशों की निगरानी, n-ब्यूटानॉल के साथ विकास: एच2ओ: एसिटिक एसिड एक 1:1:1 अनुपात में, और सीरियम अमोनियम हीटिंग के बाद molybdate के समाधान से धुंधला । Lyophilize27 अंश युक्त उत्पाद 2 मध्यवर्ती प्राप्त करने के लिए (११५ मिलीग्राम, सफेद पाउडर के रूप में ८६%) । एनएमआर28 और मास स्पेक्ट्रोस्कोपी29 (अनुपूरक डेटा फ़ाइल देखें) द्वारा उत्पाद की विशेषताएं ।
  2. 3 मध्यवर्ती की तैयारी
    1. वजन शुरू सामग्री 2 ( चित्रा 2में दिखाया गया है, p-methoxyphenyl-O-β-d-galactopyranosyl-(1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl-(1 → 2)-α-d-mannopyranoside (८० मिलीग्राम, ०.१२२ mmol)) में एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और Tris में इसे भंग 5 मिमी की एक अंतिम glycan एकाग्रता तैयार करने के लिए MnCl2 (10 मिमी) युक्त बफर (25 मिमी, पीएच ७.५).
    2. guanosine 5 के 2 समकक्ष जोड़ें '-diphospho-β-L-fucose disodium नमक (जीडीपी-बकवास) ।
    3. एंजाइम α की १५० इकाइयों जोड़ें-1, 3 fucosyl transferases से हेलिकोबेक्टर हेलिकोबेक्टर (Hp1-3ftδ २६६९५), और 15 एच के लिए ३७ ओसी पर मिश्रण मशीन ।
    4. 1.1.4 कदम का पालन करें ।
    5. स्टेप 1.1.5 का पालन करें ।
    6. का पालन करें चरण 1.1.6 प्राप्त करने के लिए मध्यवर्ती 3 (८२ mg, ८४%) सफेद पाउडर के रूप में । एनएमआर और मास स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा उत्पाद की विशेषताएं (अनुपूरक डेटा फ़ाइल देखें) ।
  3. 4 और 5 मॉड्यूल की तैयारी
    1. वजन यौगिक 2, p-methoxyphenyl-O-β-d-galactopyranosyl-(1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl-(1 → 2)-α-d-mannopyranoside (०.२३० g, ०.३६० mmol) या यौगिक 3, पृ- methoxyphenyl-O-β-d-galactopyranosyl-(1 → 4)-[α-L-fucopyranosyl-(1 → 3) -2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl]-(1 → 2)-α-d-mannopyranoside (०.१०० g, ०.१२५ mmol) में एक 25 मिलीलीटर एकल गर्दन गोल नीचे कुप्पी और 30 मिनट के लिए वैक्यूम के तहत सूखी ।
    2. वैक्यूम से कुप्पी निकालें, नाइट्रोजन गैस के साथ भरें, एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ने के लिए, यह एक रबर पट के साथ टोपी, और एक नाइट्रोजन गुब्बारा देते हैं ।
    3. सूखी pyridine और एसिटिक एनहाइड्राइड के 3 मिलीलीटर (एसी2ओ) के 7 मिलीलीटर सुई 0 ओसी में एक बर्फ स्नान पर रखा कुप्पी में । ६००-७०० rpm पर एक चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग कमरे के तापमान पर 12 घंटे के लिए परिणामी प्रतिक्रिया हिलाओ । ५० ओसी पर 0-10 mbar के एक वैक्यूम दबाव में एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना ।
    4. dichloromethane (डीसीएम) के 30 मिलीलीटर और संतृप्त जलीय सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट (NaHCO3) (2 x 20 एमएल) के साथ एक ५० मिलीलीटर विभाजक कीप में निकालने के प्रयोग से कच्चे तेल का मिश्रण पतला ।
    5. फिर से डीसीएम (3 x 15 मिलीलीटर) के साथ जलीय परत निकालें और सोडियम सल्फेट पर संयुक्त कार्बनिक परतों सूखी । साथ ही निस्पंदन द्वारा सोडियम सल्फेट निकालें और डीसीएम (5 एमएल) के साथ धो लें । ४० ओसी पर ४०० mbar वैक्यूम दबाव में एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग विलायक लुप्त हो जाना ।
    6. सिलिका बिस्तर के शीर्ष पर डीसीएम के 2 मिलीलीटर में कच्चे मिश्रण के समाधान लोड ।
    7. स्तंभ को टोल्यूनि युक्त मिश्रण से Elute करें और टोल्यूनि में 0-20% एसीटोन से एसीटोन और 5-10 मिलीलीटर के अंशों को एकत्र करें ।
    8. मॉनिटर टीएलसी द्वारा एकत्र अंशों (1.1.4 कदम और 1.1.6), टोल्यूनि के साथ विकसित/एसीटोन (7/3), और सीरियम अमोनियम एक गर्म थाली पर हीटिंग के बाद molybdate के समाधान के साथ धुंधला ।
    9. ७२% और ८५% पैदावार में सफेद फोम के रूप में वांछित उत्पादों को प्राप्त करने के लिए एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग कर अंशों युक्त उत्पाद लुप्त हो जाना, क्रमशः ।
    10. acetonitrile के 7 मिलीलीटर में उत्पादों को भंग: टोल्यूनि: H2O में 4:2:1 अनुपात में एक 25 मिलीलीटर गोल-नीचे कुप्पी ।
    11. एक बर्फ स्नान का उपयोग कर 0 ओसी को ठंडा करते हुए सीरियम अमोनियम नाइट्रेट (2 समकक्ष) जोड़ें । 3 ज के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया हिलाओ ~ ५००-८०० rpm ।
    12. के बाद टीएलसी शुरू सामग्री की कुल खपत इंगित करता है (टीएलसी टोल्यूनि के साथ विकासशील/एसीटोन (7/3) और २५४ एनएम में यूवी अवशोषक द्वारा visualizing या सीरियम अमोनियम हीटिंग के बाद molybdate के समाधान के साथ धुंधला द्वारा), के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण पतला एथिल एसीटेट (30 एमएल) और H2O (15 x 2 एमएल) के साथ निकालें ।
    13. संतृप्त सोडियम क्लोराइड (NaCl) समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ संयुक्त कार्बनिक परतों निकालें ।
    14. ४० ओसी पर २४० mbar वैक्यूम दबाव में एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग विलायक लुप्त हो जाना ।
    15. सिलिका बिस्तर के ऊपर डीसीएम के 2 मिलीलीटर में कच्चे उत्पाद के समाधान लोड । टोल्यूनि और एसीटोन (टोल्यूनि में 0-20% एसीटोन) युक्त मिश्रण के साथ स्तंभ Elute और 5-10 मिलीलीटर के अंशों को एकत्र करें । टीएलसी द्वारा एकत्र अंशों की निगरानी, टोल्यूनि/एसीटोन (7/3) के साथ विकसित करना ।
    16. उत्पाद-७७ mbar निर्वात और ४० ओसी पर एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर सफेद फोम के रूप में वांछित उत्पादों को पाने के अंश लुप्त हो जाना ।
    17. संबंधित अल्कोहल को एक 25 एमएल वाले एकल गर्दन वाले गोल-नीचे कुप्पी में 10 मिलीलीटर और ठंडा करने के लिए-30 oC में भंग करें ।
    18. Add diethylaminosulfur trifluoride (DAST, 2 समकक्ष) । 2 एच के लिए-30 ओसी पर प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ ।
    19. के बाद टीएलसी शुरू सामग्री की खपत इंगित करता है (टीएलसी टोल्यूनि के साथ विकासशील/एसीटोन (4/1) और २५४ एनएम में यूवी अवशोषक द्वारा visualizing या सीरियम अमोनियम हीटिंग के बाद molybdate के समाधान के साथ धुंधला द्वारा), डीसीएम के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण पतला (30 एमएल) , और संतृप्त NaHCO3 (15 x 2 मिलीलीटर) से धो लें ।
    20. संतृप्त NaCl समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ संयुक्त कार्बनिक परत निकालें, यह निर्जल मैग्नीशियम सल्फेट जोड़ने के द्वारा सूखी, डीसीएम (5 मिलीलीटर) के साथ एक धोने के बाद मिश्रण फ़िल्टर, और यह एक १०० मिलीलीटर एकल गर्दन दौर नीचे कुप्पी में इकट्ठा ।
    21. ४० ओसी पर ४०० mbar वैक्यूम दबाव में एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग विलायक लुप्त हो जाना ।
    22. सिलिका बिस्तर के ऊपर डीसीएम की 2 मिलीलीटर में क्रूड उत्पाद का समाधान लोड । Elute टोल्यूनि और एसीटोन (टोल्यूनि में 0-20% एसीटोन) के मिश्रण के साथ कॉलम और 5-10 मिलीलीटर के अंश इकट्ठा ।
    23. टीएलसी द्वारा एकत्र अंशों की निगरानी, टोल्यूनि/एसीटोन (7/3) के साथ विकसित करना ।
    24. उत्पाद एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग कर वांछित उत्पादों को पाने के लिए 4, [2, 3, 4, 6-ओ-tetraacetyl-β-d-galactopyranosyl]-(1 → 4)-[3, 6-o-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl]-(1 → 2)-3, 4, 6- ओ-triacetyl-α-डी-mannopyranosyl फ्लोराइड (५४% से अधिक 2 कदम) और 5, [2, 3, 4, 6-ओ-tetraacetyl-β-d-galactopyranosyl]-(1 → 4)-[2, 3, 4-ओ-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1 → 3)-3, 6-ओ-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1 → 2)- 3, 4, 6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl फ्लोराइड (६७% से अधिक 2 कदम) के रूप में सफेद ठोस.
    25. एनएमआर और मास स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा उत्पाद की विशेषताएं (अनुपूरक डेटा फ़ाइल देखें) ।

2. Glycan 10 की तैयारी

  1. 7 intermidiate की तैयारी
    1. वजन चांदी triflate (AgOTf) (०.०३९ g, ०.१५५ mmol), भा ज प (cyclopentadienyl) hafnium (IV) dichloride (Cp2एचएफसीएल2) (०.०४१ g, ०.१०८ mmol) एक 25-एमएल एकल गर्दन गोल नीचे कुप्पी में, यह schlenk लाइन वैक्यूम के तहत सूखी 30 मिनट के लिए, यह से निकालें वैक्यूम, और नाइट्रोजन गैस के साथ भरें ।
    2. स्थानांतरण हौसले से सूख 4 Å आण्विक छलनी (०.२ g) AgOTf और सीपी2एचएफसीएल2युक्त कुप्पी में, एक चुंबकीय हलचल बार, पट के साथ टोपी तुरंत जोड़ें, और एक नाइट्रोजन गुब्बारा जोड़ें ।
    3. एक सूखी गिलास सिरिंज के साथ कुप्पी में 3 मिलीलीटर सूखी टोल्यूनि स्थानांतरण । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ और फिर 0 ओसी को शांत ।
    4. दाता 4 (चित्रा 2, ०.०४३ जी, ०.०४६ mmol) और स्वीकारकर्ता 6, 5-Azidopentyl-o-2-o-एसिटाइल-4 के एक समाधान इंजेक्षन, 6-ओ-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1 → 4)-o-(3, 6-डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-(2, 2, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-O-3, 6-डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-(2, 2, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (चित्रा 3, ०.०४५ g, ०.०३१ mmol) 3 मिलीलीटर टोल्यूनि में पट के माध्यम से कुप्पी में एक 10 एमएल सिरिंज का उपयोग कर 0 हे C. 3 एच के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ ।
    5. टीएलसी के बाद शुरू सामग्री की खपत इंगित करता है (टीएलसी, डीसीएम के साथ विकासशील/एसीटोन (8.5/1.5) और २५४ एनएम पर यूवी अवशोषक द्वारा visualizing या सीरियम अमोनियम हीटिंग के बाद molybdate के समाधान के साथ धुंधला द्वारा), 10 इंजेक्शन द्वारा प्रतिक्रिया बुझाने triethyl अमीन के समकक्ष.
    6. एक celite बिस्तर के माध्यम से आणविक छलनी फ़िल्टर एक ५०-एमएल राउंड तली हुई कुप्पी में, और आगे एथिल एसीटेट के 10 मिलीलीटर के साथ धो लें । एक ५० मिलीलीटर विभाजक कीप में जलीय NaHCO3 (2 x 20 एमएल) के एक संतृप्त समाधान के साथ संयुक्त कार्बनिक परतों निकालें । एथिल एसीटेट (3 x 15 मिलीलीटर) के साथ जलीय परत निकालें ।
    7. संतृप्त NaCl समाधान (5 मिलीलीटर) के साथ संयुक्त कार्बनिक परतों निकालें, यह निर्जल मैग्नीशियम सल्फेट का उपयोग करके सूखी, मिश्रण फिल्टर करने के लिए मैग्नीशियम सल्फेट हटाने, एथिल एसीटेट (3 x 15 मिलीलीटर) के साथ धोने, और एक १०० मिलीलीटर में निस्पंदन इकट्ठा गोल तली हुई कुप्पी ।
    8. ४० ओसी पर २४० mbar वैक्यूम दबाव में एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग विलायक लुप्त हो जाना ।
    9. सिलिका बिस्तर कॉलम के शीर्ष पर डीसीएम में कच्चे उत्पाद के समाधान लोड । Elute के साथ इस कॉलम को डीसीएम और एसीटोन (डीसीएम में 0-10% एसीटोन) युक्त मिश्रण से और 5-10 एमएल के अंशों को इकट्ठा करें ।
    10. टीएलसी द्वारा एकत्र अंशों की निगरानी, डीसीएम के साथ विकसित/एसीटोन (8.5/ intermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2 प्राप्त करने के लिए एक रोटरी वाष्पर का उपयोग कर उत्पाद युक्त अंशों लुप्त हो जाना, 3, 4, 6-ओ-tetraacetyl-β-d-galactopyranosyl]-(1 → 4)-[3, 6-o-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl]-(1 → 2)-[ 3, 4, 6-o-triacetyl-α-d-mannopyranosyl]}-(1 → 3)-[2-ओ-एसिटाइल-4, 6-ओ-benzylidine-β-d-mannopyranosyl-(1 → 4)-o-(3, 6-डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-(2, 2, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-ओ-3, 6-डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-( 2, 2, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (०.०५२ जी, ७०%), सफेद फोम के रूप में ।
    11. एनएमआर और मास स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा उत्पाद की विशेषताएं (अनुपूरक डेटा फ़ाइल देखें) ।
  2. 8 intermidiate की तैयारी
    1. वजन hexasaccharide 7 (चित्रा 3, ०.०४० जी, ०.०१६ mmol) एक 25 मिलीलीटर एकल गर्दन दौर नीचे कुप्पी में, यह 1 घंटे के लिए निर्वात के तहत सूखी, यह वैक्यूम से निकालें, यह नाइट्रोजन गैस के साथ भरें, एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें, और यह एक रबर पट के साथ टोपी ।
    2. acetonitrile के 3 मिलीलीटर स्थानांतरण: मेथनॉल (MeOH) (2:1 अनुपात) कुप्पी में ।
    3. प्रतिक्रिया कुप्पी में p-टोल्यूनि sulfonic acid मोनोहाइडे (०.००१ g, ०.००८ mmol) जोड़ें और 5 ज के लिए ८०० rpm पर प्रतिक्रिया हिलाओ ।
    4. के बाद टीएलसी सामग्री शुरू करने के comsumption इंगित करता है (टीएलसी, डीसीएम के साथ विकासशील/एसीटोन (8.5/1.5), और २५४ एनएम पर यूवी अवशोषक द्वारा visualizing या सीरियम अमोनियम हीटिंग के बाद molybdate के समाधान के साथ धुंधला द्वारा), 10 इंजेक्शन द्वारा प्रतिक्रिया बुझाने triethyl अमीन के समकक्ष.
    5. ४० ओसी पर ३३७ mbar वैक्यूम दबाव में एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग विलायक लुप्त हो जाना ।
    6. डीसीएम के लगभग 2 मिलीलीटर के साथ कच्चे मिश्रण भंग और यह सिलिका बिस्तर के शीर्ष पर लोड ।
    7. Elute डीसीएम और एसीटोन (डीसीएम में 0-10% एसीटोन) के मिश्रण के साथ कॉलम और 5-10 मिलीलीटर के अंश इकट्ठा । टीएलसी द्वारा एकत्र अंशों की निगरानी, डीसीएम के साथ विकसित/एसीटोन (8.5/ ४०० mbar वैक्यूम और ४० oC पर एक रोटरी वाष्पन का उपयोग विलायक लुप्त हो जाना ।
    8. कम दबाव के तहत अवशेषों को सूखा 8, 5-Azidopentyl-ओ-(2-o-एसिटाइल-3, ४, ६-त्रि-ओ-benzyl-सीईडी दबाव देना → ३) -2-ओ-एसिटाइल-४, ६-ओ-benzylidine-β-डी-mannopyranosyl-(१ → ४)-ओ-(३, ६- डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-ओ-3, 6-डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (चित्रा 3, ०.०२२ जी, एक सफेद ठोस के रूप में ५७%) । एनएमआर और मास स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा उत्पाद की विशेषताएं (अनुपूरक डेटा फ़ाइल देखें) ।
  3. 9 intermidiate की तैयारी
    1. intermidiate 9 (चित्रा 3) की तैयारी दाता 5 (०.०१५ जी, १३.२ µmol) और स्वीकार 8 (चित्रा 3, ०.०२० जी, ८.८० µmol) का उपयोग कर पूरा किया गया ।
    2. AgOTf (०.०११ जी, ४४.१ µmol) और सीपी2एचएफसीएल2 (०.०१२ ग्राम, ३०.८ µmol) एक मोटरों के रूप में इस्तेमाल किया गया ।
    3. 2.1.10 करने के लिए कदम 2.1.1 करने के लिए मध्यवर्ती 9, 5-Azidopentyl-o-{[2, 3, 4, 6-ओ-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1 → 4)-[3, 6-o-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1 → 2)-[3, 4, 6-ओ-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(१ → ३)-{२, ३, ४, ६-ओ-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(१ → ४)-[२, ३, ४-ओ-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(१ → ३)-३, 6-o-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl]-(1 → 2)-3, 4, 6-ओ-triacetyl-α-डी-mannopyranosyl}-(1 → 6)-[2- ओ-एसिटाइल-β-D-mannopyranosyl-(1 → 4)-o-(3, 6-डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-(2, 2, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-d-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2, 2, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-d-glucopyranosyl)-d-glucopyra (०.०१० g, ३४%), as सफेद फोम ।
  4. intermidiate के वैश्विक संरक्षण
    1. एक 25 मिलीलीटर एकल गर्दन दौर नीचे कुप्पी, एक चुंबकीय हलचल पट्टी, एक रबर पट के साथ टोपी में जोड़ें, और एक नाइट्रोजन गुब्बारा जोड़ने में 9 (०.०१० ग्राम, २.९ µmol) यौगिक वजन ।
    2. 1, 4 dioxane: H2O (4:1) की कुप्पी में 2 मिलीलीटर स्थानांतरण । जोड़ें लिथियम हीड्राकसीड (LiOH) (०.००५ g, ५०% wt द्वारा.) कुप्पी में । 12 घंटे के लिए ९०-१०० ओसी पर प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ और यह आरटी पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    3. एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना और 1 घंटे के लिए निर्वात के तहत कुप्पी सूखी, यह नाइट्रोजन के साथ भरें, यह निर्वात कई गुना से दूर है, और एक रबर पट के साथ टोपी ।
    4. सूखी pyridine के 4 मिलीलीटर और पट के माध्यम से कुप्पी में एसिटिक एनहाइड्राइड के 2 मिलीलीटर इंजेक्षन 0 oC. पर 12 एमएल सिरिंज के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण हलचल
    5. ५० ओसी पर 0-10 mbar वैक्यूम दबाव में एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना ।
    6. डीसीएम की 30 मिलीलीटर का उपयोग कर कच्चे मिश्रण को भंग और एक ५० मिलीलीटर विभाजक कीप में संतृप्त जलीय NaHCO3 (2 x 20 एमएल) के साथ समाधान निकालने ।
    7. फिर से डीसीएम (3 x 15 एमएल) के साथ जलीय परत निकालें । एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग विलायक लुप्त हो जाना ।
    8. C18 सिलिका बिस्तर के ऊपर डीसीएम के लगभग 2 मिलीलीटर में उत्पाद का एक समाधान लोड । Elute पानी और मेथनॉल (पानी में मेथनॉल के 0-100%) के मिश्रण के साथ कॉलम और 5-10 मिलीलीटर के अंश इकट्ठा ।
    9. उत्पाद भागों लीजिए और सफेद फोम के रूप में वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए कम दबाव के तहत लुप्त हो जाना ।
    10. एक 25 मिलीलीटर गोल नीचे कुप्पी में 5 मिलीलीटर सूखी मेथनॉल में उत्पाद भंग और यह एक रबर पट के साथ टोपी ।
    11. मेथनॉल में सोडियम methoxide (NaOMe) के ०.१ मिलीलीटर स्थानांतरण और शांत करने के लिए 0 oC एक बर्फ स्नान का उपयोग कर और 12 एच के लिए मिश्रण हलचल ।
    12. एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग कर विलायक निकालें और उच्च वैक्यूम के तहत उत्पाद सूखी ।
    13. मेथनॉल के 5 मिलीलीटर में कच्चे उत्पादों को भंग: एच2O: एसिटिक एसिड (6:3:1) ।
    14. पैलेडियम हीड्राकसीड (पीडी (OH)2) जोड़ें (५०% wt द्वारा) और हाइड्रोजन वातावरण के तहत प्रतिक्रिया हलचल 15 एच के लिए एक हाइड्रोजन गुब्बारा का उपयोग कर ।
    15. एक celite बिस्तर के माध्यम से प्रतिक्रिया फ़िल्टर और 2 मिलीलीटर डीडी पानी की 2 मिलीलीटर के बाद मेथनॉल के साथ धो लें ।
    16. एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना ।
    17. पानी की लगभग 1 मिलीलीटर के साथ कच्चे तेल के मिश्रण को भंग करने और यह polyacrylamide जेल बिस्तर के शीर्ष पर लोड ( सामग्री की तालिकादेखें) । उत्पाद को पानी से Elute और 1-2 मिलीलीटर के अंश एकत्र करें ।
    18. टीएलसी द्वारा एकत्र अंशों की निगरानी, n-ब्यूटानॉल: H2O: एसिटिक अम्ल (1:1:1) के साथ विकसित करना ।
    19. उत्पाद भागों और lyophilize ले लीजिए वांछित उत्पाद 10 प्राप्त करने के लिए , 5-Aminopentyl-β-d-galactopyranosyl-(1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl-(1 → 2)-α-d-mannopyranosyl]-(1 → 3),-[β-D-galactopyranosyl-(1 → 4)-( α-L-fucopyranosyl-(1 → 3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1 → 2)-α-d-mannopyranosyl]-(1 → 6)-β-d-mannopyranosyl-(1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl-(1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranoside (०.००२ g, ३६%), के रूप में एक सफेद पाउडर ।
    20. एनएमआर और मास स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा उत्पाद की विशेषताएं (अनुपूरक डेटा फ़ाइल देखें) ।

3. Phosphonic एसिड टेल के साथ Glycans की तैयारी19,22

  1. एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे कुप्पी में संबंधित glycan (2-5 µmol) तौलना, एक चुंबकीय हलचल पट्टी जोड़ने के लिए, और यह एक रबर पट के साथ टोपी ।
  2. स्थानान्तरण ४०० हौसले से सूख dimethylformamide के µ l ।
  3. जोड़ [2 (2 (2 (बीआईएस (benzyloxy) phosphoryl) ethoxyethoxy) एथिल (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl) कार्बोनेट] (10-25 µmol, घर में तैयार) को glycan समाधान । 5 एच के लिए ८०० rpm पर मिश्रण हिलाओ ।
  4. ४० ओसी पर 5-10 mbar वैक्यूम दबाव में एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना ।
  5. polyacrylamide जेल बिस्तर के शीर्ष पर पानी और लोड की ०.५ मिलीलीटर में प्रतिक्रिया मिश्रण भंग ( सामग्री की तालिकादेखें). Elute पानी का उपयोग कर उत्पाद और 1-2 मिलीलीटर के अंश इकट्ठा ।
  6. 26टीएलसी द्वारा एकत्र अंशों की निगरानी करें । एक टीएलसी प्लेट पर प्रतिक्रिया मिश्रण हाजिर, और ०.२५ मीटर सीरियम अमोनियम molybdate के दाग समाधान जोड़ने; एक गर्म थाली का उपयोग कर हीटिंग द्वारा पालन करें । एक सफेद पाउडर के रूप में वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए भिन्न और lyophilize युक्त उत्पाद ले लीजिए ।
  7. पानी के 2 मिलीलीटर में उत्पाद को भंग करने और पीडी (OH)2 (५०% वजन द्वारा) जोड़ें । 15 एच के लिए एक हाइड्रोजन गुब्बारा का उपयोग हाइड्रोजन वातावरण के तहत ८०० rpm पर प्रतिक्रिया हिलाओ ।
  8. एक फ्लक्स-कैलक्लाइंड बिस्तर के माध्यम से प्रतिक्रिया फिल्टर और 2 मिलीलीटर आसुत de-जल के 2 मिलीलीटर द्वारा पीछा मेथनॉल के साथ धो लो । ४० ओसी पर ३०० mbar वैक्यूम दबाव में एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना ।
  9. पानी की लगभग 1 मिलीलीटर के साथ कच्चे तेल के मिश्रण को भंग करने और यह polyacrylamide जेल बिस्तर के शीर्ष पर लोड ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  10. उत्पाद को पानी से Elute और 1-2 मिलीलीटर के अंश एकत्र करें । 26टीएलसी द्वारा एकत्र अंशों की निगरानी करें । Lyophilize अंश (तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर उत्पाद फ्रीज तो एक निर्वात के तहत lyophilizer पर जगह) एक सफेद पाउडर के रूप में वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए । एनएमआर और मास स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा उत्पादों की विशेषताएं (अनुपूरक डेटा फ़ाइल देखें) D2का उपयोग कर एक विलायक के रूप में ।

4. Glycan सरणी

  1. एल्यूमिनियम लेपित ग्लास स्लाइड (ACG स्लाइड) की तैयारी 19 , 20 , 22
    नोट: एल्यूमीनियम लेपित ग्लास स्लाइड का निर्माण तनु फिल्म प्रौद्योगिकी प्रभाग, साधन प्रौद्योगिकी अनुसंधान केंद्र और राष्ट्रीय अनुप्रयुक्त अनुसंधान प्रयोगशालाओं, सिंचु विज्ञान पार्क, ताइवान में किया गया था ।
    1. लेपित स्लाइड पैक, वैक्यूम-उंहें नाव के गठन को रोकने के लिए सील, और सतह यांगीकरण के लिए विद्युत प्रतिक्रिया जब तक सील रखो ।
  2. एल्यूमीनियम लेपित कांच स्लाइड की सतह यांग ीकरण 19 , 20 , 22
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर तापमान नियंत्रित मशीन सेट करें । ०.३ मीटर oxalic एसिड जलीय घोल तैयार करें और इसे एक आइस बाथ में रखें । ५०० मिलीलीटर चोंच लें, एक चुंबकीय सरगर्मी पट्टी जोड़ें ।
    2. ५०० मिलीलीटर चोंच के लिए ०.३ मीटर oxalic एसिड हस्तांतरण, और फिर समाधान में एक कैथोड के रूप में एक 10 सेमी लंबी प्लेटिनम रॉड जगह है । उभार रखने के (३०० rpm) में oxalic एसिड की यांगता प्रक्रिया के दौरान ।
    3. लैब अनुरेखक सॉफ्टवेयर पर बारी, "सेट" बटन तो पर क्लिक करें "फंक्शन च्वाइस स्वीप वोल्टेज." सेट शुरू और वोल्टेज रोकने के लिए २५.८ V, अंक की संख्या के लिए १००, 1 के लिए अनुपालन, और स्वीप देरी करने के लिए १,२०० ms और क्लिक करें "ठीक है."
    4. दबाना एल्यूमीनियम लेपित कांच पक्ष कैथोड की ओर का सामना करना पड़ । "परीक्षण चलाएं" बटन पर क्लिक करें । वर्तमान माप (~ 8-10 mA) पर गौर ।
    5. सतह यांग के बाद, स्लाइड को अच्छी तरह से डबल आसुत जल के साथ धो, नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी शुद्ध, और फिर आगे उपयोग तक एक 30% सापेक्ष आर्द्रता चैंबर में स्टोर ।
  3. ACG glycan microarray का निर्माण 22
    1. १०० µ एल सभी monovalent glycans (आइ-XI) के ईथीलीन ग्लाइकोल में 10 mM एकाग्रता व्यक्तिगत रूप से तैयार करें ।
    2. मुद्रण बफर के साथ ऊपर glycan पतला (८०% ईथीलीन ग्लाइकोल और 20% de-जल) १०० µ मीटर एकाग्रता बनाने के लिए ।
    3. hetero-ligand अध्ययन के लिए, व्यक्तिगत आइ-XI glycans के 5 µ l को तैयार करें, और प्रत्येक जोड़ें 5 µ l को मैन5GlcNAc2 (1:1 अनुपात).
    4. रोबोट पिन द्वारा microarrays प्रिंट ( सामग्री की तालिकादेखें) ACG स्लाइड पर पहले से तैयार glycans के ०.६ nL के जमाव से31.
    5. बाध्यकारी परख से पहले एक आर्द्र नियंत्रित सूखी बॉक्स में मुद्रित स्लाइड की दुकान ।
  4. मानचित्रण glycan epitopes के एचआईवी-1 मोटे तौर पर बेअसर एंटीबॉडी PG9 22
    1. तैयार 1 मिलीलीटर BSA निहित PBST बफर, 3% डब्ल्यू/
    2. PG9 (५० µ g/mL) के ७० µ l को PBST बफर में तैयार करें (BSA बफर, 3% w/
    3. माध्यमिक फ्लोरोसेंट टैग एंटीबॉडी गधा विरोधी मानव आईजीजी (Alexa Fluor ६४७ संयुग्मित) ५० µ जी/एमएल PBST बफर में (BSA निहित PBST बफर, 3% डब्ल्यू/वी) के १२० µ एल तैयार अंधेरे में ।
    4. मिश्रण प्राथमिक एंटीबॉडी (PG9) और माध्यमिक फ्लोरोसेंट टैग एंटीबॉडी 1:1 अनुपात में (६० µ एल प्रत्येक) । 4 ° c में 30 मिनट के लिए मिश्रित एंटीबॉडी की मशीन ।
    5. स्लाइड मशीन चैंबर जो 16 कुओं में विभाजित है में ACG स्लाइड लोड । स्थानांतरण १०० µ एल मिश्रित एंटीबॉडी के glycan सरणी के लिए और 4 ° c पर गर्मी 16 एच के लिए
    6. प्लास्टिक बाहर मिश्रित एंटीबॉडी । स्लाइड मशीन कक्ष निकालें ।
    7. PBST बफर में पहले स्लाइड धो (पंजाब और ०.०५% के बीच-20), de-जल के बाद और स्पिन २,००० x g पर सूखी
    8. microarray छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें). नीचे की गई सरणी सुविधाओं के साथ कोई स्लाइड संमिलित करना ।
    9. "सेटिंग्स" मेनू पर क्लिक करें, पिक्सेल प्रति 5 µm के लिए छवि संकल्प सेट, और १००% करने के लिए PMT450 और बिजली के साथ ६३५ एनएम पर तरंग दैर्ध्य ।
    10. "स्कैन" बटन पर क्लिक करें इमेजिंग स्लाइड शुरू करने के लिए ।
    11. "फ़ाइल" चिह्न tif स्वरूप में स्कैन छवि को सहेजने के लिए क्लिक करें ।
    12. सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता की मार्गदर्शिका का पालन करते हुए छवि विश्लेषण करें३२।
    13. प्रतिदीप्ति की कुल तीव्रता की गणना और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर३३ का उपयोग कर वर्णन ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      नोट: यहाँ, सभी डेटा बिंदुओं के लिए औसत प्रतिशत त्रुटि त्रुटि पट्टियों द्वारा प्रस्तुत किया गया है ।

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Representative Results

N-glycans की एक विस्तृत सरणी के संश्लेषण के लिए एक मॉड्यूलर chemo-एंजाइमी रणनीति चित्रा 1में प्रस्तुत किया गया है । रणनीति तथ्य यह है कि विविधता तीन महत्वपूर्ण मॉड्यूल के chemo-एंजाइमी संश्लेषण द्वारा शुरुआत में बनाया जा सकता है पर आधारित है, 3 में α-विशिष्ट mannosylation द्वारा पीछा किया-ओ और/आम के mannose अवशेषों की 6-o स्थिति कोर trisaccharide ऑफ N-glycans । द्वि की संरचनात्मक विविधता को ध्यान में रखते हुए, त्रिकोणीय, और टेट्रा-एंटीना जटिल प्रकार N-glycan संरचनाओं, हम मानते थे कि oligosaccharyl दाताओं का एक सेट और पूर्व स्थापित alkyl के साथ कोर trisaccharides स्वीकार्यता शुरू के रूप में इस्तेमाल किया जा handlecould सामग्री वांछित संरचनात्मक विविधता (चित्रा 1) उत्पंन करने के लिए । एक जटिल glycan पुस्तकालय के निर्माण में glycosyl फ्लोराइड दाताओं की प्रयोज्यता पहले से ही सिद्ध किया गया है21.

हमारी रणनीति की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए, एक द्वि-एंटेना isomeric संरचना (10, चित्रा 3) संश्लेषण के लिए चुना गया था. D1 एआरएम एंटीना 4 और D2 हाथ एंटेना 5 glycan के 10 chemo-एंजाइमी तरीकों द्वारा बड़े पैमाने पर उत्पन्न किया गया. विशेष रूप से, disaccharide स्वीकारकर्ता 1 β-1, 4-galactosyltransferase और uridine 5 '-diphosphogalactose (UDP-Gal) trisaccharide 2के लिए प्रपत्र का उपयोग कर enzymatically galactosylated था । अगले, मध्यवर्ती 2 GlcNAc 3 पर fucosylated था-O α की उपस्थिति में स्थिति-1, 3-fucosyltransferase से हेलिकोबेक्टर हेलिकोबेक्टर (Hpα1, 3FT) के लिए वांछित tetrasaccharide 3वहन । कोर के लिए रासायनिक बंधाव के लिए, बिल्डिंग ब्लॉकों 2 और 3 पहले peracetylated थे, और कम करने के अंत पी-methoxy phenol समूह हटा दिया गया था । अंत में, फ्लोराइड DAST की उपस्थिति में स्थापित किया गया था पाने के लिए वांछित मॉड्यूल 4 और 5, क्रमशः (चित्रा 2).

हाथ में वांछित मॉड्यूल होने, हम अगले stereoselective 3 के लिए आगे बढ़ना-O ग्लाइकोसिलेशन के कोर trisaccharide 6 के लिए 4 रजत triflate के तहत catalysis और hafnocene dichloride संबंधित hexasaccharide प्रदान करने के लिए 7 (चित्रा 3). 4 मास्किंग कि benzylidene संरक्षण, 6-ओह उत्प्रेरक पी-टोल्यूनि sulfonic एसिड (पी-TSA) का उपयोग कर हटा दिया गया था । इसकी प्रतिक्रिया का लाभ उठाते हुए, 6 प्राथमिक-OH 8 के लिए आवश्यक decasaccharide 9प्राप्त करने के लिए समान प्रायोगिक शर्तों के तहत 5 फ्लोराइड मॉड्यूल के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की थी । पिछले पर, वैश्विक संरक्षण के लिए glycan 10है, जो आगे एनएमआर और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी (अनुपूरक डेटा फ़ाइल देखें) का उपयोग कर विशेषता थी पाने के लिए प्रदर्शन किया गया था ।

Glycans को कम करने के अंत में एक pentyl अमीन पूंछ युक्त phosphonic एसिड लिंकर्स के साथ संशोधित और phosphonate रसायन विज्ञान के माध्यम से ACG सतह से जुड़े थे (चित्रा 4) । पिछले पर, एचआईवी-1 bNAb PG9 अपनी glycan विशिष्ट होमो का उपयोग कर के लिए जांच की और hetero-glycans arrays के लिए पहली बार है कि PG9 में आसंन heteroglycans के साथ बातचीत के लिए प्रदर्शित किया गया V1/V2 पाश के लूप-1 gp120 सतह (चित्रा 5) ।

Figure 1
चित्रा 1: एक सामांय मॉड्यूलर रणनीति N-glycans की तैयारी के लिए । (क) मानव नच पर सामान्यतः घटित होने वाली इस कार्यनीति द्वारा उत्पन्न एन-glycans की संख्या २०,००० से अधिक होने का अनुमान है. (ख) इस chemo-एंजाइमी दृष्टिकोण द्वारा तैयार किए गए तीन प्रकार के मॉड्यूल जिन्हें α-seletive glycosylations के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: मॉड्यूल के Chemoenzymatic संश्लेषण. i, UDP-गैलेक्टोज, β 1, 4-GalT, 15 एच, ८६%; द्वितीय, सकल घरेलू उत्पाद-fucose, α 1, 3-FucT, 15 एच, ८४%; iii, (1) एसी2O, pyridine, भ, 12 ज; (1) कर सकते हैं, ACN: टोल्यूनि: H2o, (3) DAST, CH2सीएल2,-30 OC. कर सकते हैं: सीरियम अमोनियम नाइट्रेट; DAST: Diethylaminosulfur trifluoride.
उत्पाद नामकरण: 1, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl-(1 → 2)-α-d-mannopyranoside; 2, पृ-methoxyphenyl-O-β-d-galactopyranosyl-(1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl-(1 → 2)-α-d-mannopyranoside; 3, p-methoxyphenyl-O-β-d-galactopyranosyl-(1 → 4)-[α-L-fucopyranosyl-(1 → 3) -2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl]-(1 → 2)-α-d-mannopyranoside; 4, [2, 3, 4, 6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1 → 4)-[3, 6-o-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl]-(1 → 2)-3, 4, 6-ओ-triacetyl-α-डी-mannopyranosyl फ्लोराइड; 5, [2, 3, 4, 6-o-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1 → 4)-[2, 3, 4-ओ-triacetyl-α-L-fucopyranosyl (1 → 3)-3, 6-o-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl]-(1 → 2)-3, 4, 6-ओ-triacetyl-α-डी-mannopyranosyl फ्लोराइड कृपया एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण ।

Figure 3
चित्र 3: D1/D2 एआरएम मॉड्यूल के लिए कोर स्वीकार करने के लिए रासायनिक ग्लाइकोसिलेशन । i, 4, AgOTf, सीपी2एचएफसीएल2, टोल्यूनि, 4 Å MS, 0 ओसी टू आरटी, ७०%; द्वितीय, पी-TSA, acetonitrile, RT, ५७%; iii, 5, AgOTf, सीपी2एचएफसीएल2, टोल्यूनि, 4 Å MS, 0 ओसी को आरटी, ३४%; iv, (1) LiOH, 1, 4-dioxane: H2O; ९० ओसी, 12 ज; (2) Ac2O, pyridine, 12 h; (3) NaOMe, MeOH, 12 ज; (4) पीडी (OH)2, MeOH: एच2ओ: HCOOH (5:3:2), एच2, ३६% । AgOTf: रजत trifluromethanesulfonate; धय2एचएफसीएल2: भा (cyclopentadienyl) hafnium dichloride, एमएस: आणविक छलनी, उत्पाद नामकरण: 7, 5-Azidopentyl-o-{[2, 3, 4, 6-ओ-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1 → 4)-[3, 6-o-diacetyl-2- acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl]-(1 → 2)-[3, 4, 6-o-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1 → 3)-[2-ओ-एसिटाइल-4, 6-ओ-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1 → 4)-o-(3, 6-डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-(2, 2, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-d-glucopyranosyl)-(1 → 4)-o-3, 6-डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-(2, 2, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-d-glucopyranosid. ८, ५-Azidopentyl-ओ-(२-ओ-एसिटाइल-३, ४, ६-त्रि-ओ-benzyl-α-डी-mannopyranosyl-(१ → ३) -2-ओ-एसिटाइल-४, 6-ओ-benzylidine-β-d-mannopyranosyl-(1 → 4)-o-(3, 6-डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-d-glucopyranosyl)-(1 → 4)-o-3, 6- डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside. 9, 5-Azidopentyl-ओ-{[2, 3, 4, 6-ओ-tetraacetyl-β-d-galactopyranosyl]-(1 → 4)-[3, 6-o-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl]-(1 → 2)-[3, 4, 6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1 → 3)-{2, 3, 4, 6- o-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1 → 4)-[2, 3, 4-ओ-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1 → 3)-3, 6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1 → 2)-3, 4, 6-ओ-triacetyl-α-d-mannopyranosyl}-(1 → 6)-[2-o-एसिटाइल-β-d-mannopyranosyl-( 1 → 4)-o-(3, 6-डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-(2, 2, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)-o-3, 6-डि-ओ-benzyl-2-deoxy-2-(2, 2, 2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-Dglucopyranoside 10, 5- Aminopentyl-β-d-galactopyranosyl-(1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl-(1 → 2)-α-d-mannopyranosyl]-(1 → 3),-[β-d-galactopyranosyl-(1 → 4) (α-L-fucopyranosyl-(1 → 3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl)-(1 → 2)- α-d-mannopyranosyl]-(1 → 6)-β-d-mannopyranosyl-(1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-d-glucopyranosyl-(1 → 4) -2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक ACG सरणी पर Glycan स्थिरीकरण. (क) phosphonate रसायन के माध्यम से ACG स्लाइड के लिए आबंध लगाव के लिए एक phosphonic एसिड पूंछ में अमीनो पूंछ के साथ glycan के रासायनिक संशोधन । (ख) एक ACG सतह पर glycans का वितरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: Glyan सरणी विश्लेषण. (क) एक ACG सरणी पर मुद्रित कर रहे हैं कि सिंथेटिक एन-glycans की संरचनाओं. (ख) PG9 के व्यक्तिगत glycans मैं-ग्यारहवीं ACG सरणी पर मुद्रित करने के लिए बाध्यकारी विश्लेषण (बाएं पैनल) और आदमी के glycan मिश्रण करने के लिए5 glycans के साथ मिश्रित मैं-xi (दायां पैनल) १०० µ m एकाग्रता के साथ । PG9 के लिए µ मीटर में दाढ़ सांद्रता कथा में दी गई है. मतलब संकेत तीव्रता और मानक त्रुटि सरणी पर पांच स्वतंत्र प्रतिकृति के लिए गणना दिखाई जाती हैं । प्रीसेट प्रतिदीप्ति छवियां दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

PG9, PG16, और PGTs १२८, १४१-१४५ सहित एचआईवी-1 bNAbs के एक वर्ग एचआईवी-1 अलग घूम के ७०-८०% बेअसर में अत्यधिक शक्तिशाली होने की सूचना दी गई । इन bNAbs के epitopes अत्यधिक पूरे एचआईवी के वेरिएंट के बीच में संरक्षित कर रहे है-1 समूह एम, इसलिए वे एक एचआईवी वैक्सीन के लिए प्रभावी immunogen डिजाइन गाइड को बेअसर कर सकते है एंटीबॉडी23,24,25 . हमारे चल रहे प्रयासों के एक भाग के रूप में एचआईवी के glycan epitopes-1 मोटे तौर पर बेअसर एंटीबॉडी की पहचान, हम उच्च mannose, संकर, और जटिल प्रकार oligosaccharides के एक पैनल के रासायनिक और एंजाइमी संश्लेषण की सूचना के लिए एक glycan सरणी के फार्म का21, 22. हालांकि, N-hydroxysuccinimide-लेपित (एन एच एस) पर सामांयतः प्रयुक्त glycan arrays ग्लास स्लाइड कम संबध कार्बोहाइड्रेट का पता लगाने में असमर्थ है-प्रोटीन बातचीत, शायद विषम glycan hydrolysis से उत्पंन होने वाले वितरण के कारण इसकी सतह पर प्रतिक्रियाशील N-hydroxysuccimide कार्यात्मक समूह । पारंपरिक सरणी स्वरूपों की सीमाओं को दूर करने के लिए, हम एक एल्यूमीनियम ऑक्साइड लेपित-कांच (ACG) स्लाइड पर एक glycan सरणी विकसित की है । हम आगे ACG सरणी और सामांय रूप से इस्तेमाल किया एन एच के बीच एक एकरूपता तुलना प्रदर्शन सरणी को साबित करने के लिए कि ACG सरणी इसकी सतह 22पर एक अधिक सजातीय glycan प्रस्तुति की पेशकश की । हमारे प्रारंभिक बाध्यकारी विश्लेषण करने में सक्षम नहीं था PG9 के किसी भी एन एच एस सरणी पर glycans के लिए बाइंडिंग का निरीक्षण (डेटा नहीं दिखाया) । इसलिए, PG9 की बाध्यकारी विशिष्टता को परिभाषित करने के लिए, glycans मैं-ग्यारहवीं एक phosphonic एसिड पूंछ से जुड़े थे और १०० µ मीटर के साथ ACG स्लाइड पर मुद्रित व्यक्तिगत glycans (चित्रा 4) । phosphonate रसायन विज्ञान के माध्यम से एक ACG स्लाइड पर glycan स्थिरीकरण की पेशकश की एक और अधिक स्थाई और समरूप वितरण । glycans के प्रत्येक पांच दोहराने के साथ मुद्रित किया गया था और स्लाइड छवियों एक प्रतिदीप्ति स्कैन से DyLight649 के बाद प्राप्त किया गया-संयुग्मित गधा विरोधी मानव आईजीजी एंटीबॉडी मशीन । व्यक्तिगत glycans के प्रति PG9 के बंधन विश्लेषण ACG सरणी पर मुद्रित (चित्रा 5, बाएं पैनल) पता चलता है कि PG9 संकर प्रकार glycan (एक्स) के साथ दृढ़ता से बातचीत की । उच्च mannose प्रकार Man5 (glycan IV) और जटिल-प्रकार glycan (XI) के लिए भी इंटरैक्शन पाया गया ।

PG9 और संकर प्रकार glycan (एक्स) के बीच आणविक स्तर की बातचीत उनके सह क्रिस्टल संरचना जानकारी की कमी के कारण निर्धारित करने के लिए मुश्किल हैं । संकर प्रकार glycan एक्स कोर के 3-ओ स्थिति में एक जटिल प्रकार के हाथ से बना है और एक trimannose बांह केंद्रीय trisaccharide के 6ओ स्थिति से जुड़ा हुआ है । PG9 के संकर glycan एक्स के बंधन से पता चलता है कि PG9 उच्च संबंध बातचीत के लिए करीब आसपास में mannose और sialic एसिड अवशेषों दोनों की आवश्यकता है । glycan संयोजन है कि सबसे अच्छा PG9 बंधन जेब में फिट बैठता है की पहचान करने के लिए, हम एक मिश्रित-glycan सरणी अध्ययन किया । Glycan चतुर्थ 1:1 तिल अनुपात में मैं-XI से हर Glycan के साथ मिलाया गया था और एक ACG सरणी पर देखा । मिश्रण में से प्रत्येक के लिए PG9 के बंधन विश्लेषण संकेत दिया कि आदमी का एक संयोजन5 और एक SCT (iv + xi) PG9 के प्रति सबसे अधिक अपनत्व के परिणामस्वरूप चतुर्थ या अकेले ग्यारहवीं की तुलना में । इसके अलावा, आदमी5 और ऐसे glycans आठवीं और एक्स के रूप में sialylated एंटेना युक्त उन मिश्रण भी22का पता लगाया गया । पहली बार के लिए, इन परिणामों की पेशकश की hetero के लिए एक सरणी आधारित सबूत-glycans ' PG9 की बाध्यकारी व्यवहार है कि एचआईवी के साथ PG9 के क्रिस्टल संरचना अध्ययन द्वारा सुझाव दिया गया था 1 gp120 V1/

अंत में, हम अत्यधिक विविध Nसे जुड़ी oligosaccharides कि मानव नच पर होने की तैयारी के लिए एक कुशल मॉड्यूलर chemo-एंजाइमी रणनीति का प्रदर्शन किया है । इसके अलावा, एक ACG सरणी के विकास के लिए अत्यंत कमजोर प्रोटीन-कार्बोहाइड्रेट बातचीत और अधिक महत्वपूर्ण बात यह निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी साधन प्रदान करता है, बातचीत है कि hetero-glycans के माध्यम से होते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने तनु फिल्म प्रौद्योगिकी प्रभाग, साधन प्रौद्योगिकी अनुसंधान केंद्र (ITRC) और राष्ट्रीय अनुप्रयुक्त अनुसंधान प्रयोगशालाओं, सिंचु विज्ञान पार्क, ताइवान का धन्यवाद किया । इस कार्य को राष्ट्रीय विज्ञान परिषद् ने समर्थन दिया (अनुदान सं. सर्वाधिक 105-0210-01-13-01) तथा जगत् Sinica ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521

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References

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रसायन विज्ञान १३२ अंक chemo-एंजाइमी संश्लेषण ACG glycan arrays एचआईवी बेअसर एंटीबॉडी N-glycans विशिष्टता profiling मॉड्यूलर दृष्टिकोण
Chemo-एंजाइमी का संश्लेषण <em>एन</em>-glycans के लिए सरणी विकास और एचआईवी एंटीबॉडी profile
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Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C. Y., Wong, C. H. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).

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