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Chemistry

Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/55855
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Summary

Un approccio modulare alla sintesi di N- glicani per il collegamento ad un vetro rivestita di ossido di alluminio diapositiva (ACG) come è stato sviluppato un microarray glycan e suo utilizzo per la profilazione di un HIV anticorpo di neutralizzazione ampiamente è stata dimostrata.

Abstract

Vi presentiamo un modo altamente efficiente per la preparazione rapida di una vasta gamma di N-collegato oligosaccaridi (stimati a superare i 20.000 strutture) che si trovano comunemente sulle glicoproteine umane. Per ottenere il desiderato diversità strutturale, la strategia ha cominciato con il chemio-enzimatico di sintesi dei tre tipi di moduli di fluoruro di oligosaccharyl, seguite da loro graduale glycosylations α-selettivo presso la 3-O e 6-O posizioni della residui di mannosio del trisaccaride nucleo comune avendo un legame β-mannoside cruciale. Abbiamo attaccato ulteriormente gli N- glicani alla superficie di una lastra di vetro rivestita di ossido di alluminio (ACG) per creare un array misto covalente per l'analisi dell'interazione ligando-etero con un anticorpo HIV. In particolare, il comportamento di associazione di un nuovo isolato HIV-1 largamente anticorpo neutralizzante (bNAb), PG9, alla miscela di ravvicinate Man5GlcNAc2 (uomo5) e 2,6-di-sialilato bi-antennary complesso tipo N- glycan (SCT ) su una matrice ACG, apre una nuova strada per guidare la progettazione immunogen efficace per lo sviluppo del vaccino HIV. Inoltre, la nostra matrice ACG incarna un potente strumento per studiare altri anticorpi anti-HIV per il comportamento di etero-ligando.

Introduction

N- glicani su glicoproteine sono covalentemente ad l'asparagina (Asn) residuo di sequon di Asn-Xxx-Ser/Thr di consenso, che interessano diversi processi biologici come il riconoscimento di conformazione, antigenicità, solubilità e lectina di proteina 1 , 2. la sintesi chimica di N-collegati oligosaccaridi rappresenta una sfida sintetica significativa a causa della loro enorme eterogeneità strutturale micro e architettura altamente ramificato. Un'attenta selezione di proteggere gruppi per ottimizzare la reattività di blocchi predefiniti, raggiungimento di selettività presso centri anomerici e uso corretto del promotore / activator(s) sono elementi chiave nella sintesi di oligosaccaridi complessi. Per risolvere il problema della complessità, una grande quantità di lavoro per far avanzare di N- glycan sintesi è stata segnalata recentemente3,4. Nonostante questi approcci robusti, trovando un metodo efficace per la preparazione di una vasta gamma di N- glicani (~ 20.000) rimane una grande sfida.

Il tasso di mutazione rapida di HIV-1 per ottenere la vasta diversità genetica e la sua capacità di fuggire da neutralizzare la risposta anticorpale, è tra le più grandi sfide per sviluppare un vaccino sicuro e profilattico contro HIV-15,6 , 7. una tattica efficace che l'HIV utilizza per evitare la risposta immunitaria è la glicosilazione post-traduzionale della busta glicoproteina gp120 con una diversificata N-collegato glicani derivato dal host glicosilazione macchine8, 9. Un recente rapporto per quanto riguarda l'analisi precisa dei ricombinanti monomerica glicosilazione di gp120 di HIV-1 da cellule 293T cellule embrionali umane del rene (HEK) suggerisce l'avvenimento di microheterogeneity strutturale con un modello caratteristico di cellula-specifico10 , 11 , 12. Pertanto, la comprensione delle specificità glycan di HIV-1 bNAbs richiede ben caratterizzati gp120 relative N- glycan strutture in quantità sufficiente per l'analisi.

La scoperta della tecnologia microarray glycan fornito alta basati su velocità effettiva esplorazione delle specificità di una gamma diversificata di carboidrati proteine, virus/batterica adesine, tossine, anticorpi e lectines13,14 . La disposizione sistematica glicani in un formato basato su chip allinearono potrebbe determinare interazioni proteina-glycan problematico bassa affinità attraverso presentazione multivalente15,16,17,18. Questa disposizione basata su chip glycan convenientemente sembra imitare efficacemente interfacce cellula-cellula. Per arricchire la tecnologia e superare il problema irregolare connesso con formati di matrice convenzionale, il nostro gruppo ha recentemente sviluppato una matrice glycan su un vetrino in vetro rivestita di ossido di alluminio (ACG) usando glicani attacco acido fosfonico per aumentare l'intensità del segnale, omogeneità e sensibilità19,20.

Per migliorare la comprensione corrente circa glycan epitopi di recente isolato HIV-1 largamente neutralizzando gli anticorpi (bNAbs), abbiamo sviluppato una strategia modulare altamente efficiente per la preparazione di una vasta gamma di N-collegato glicani21 ,22 per essere stampati su un ACG piastrina (Vedi Figura 1). Specificità di profilatura studi di HIV-1 bNAbs su una matrice ACG offerto l'individuazione insolita del comportamento di associazione di etero-glycan di altamente potente bNAb PG9 che è stato isolato da HIV infettato gli individui23,24,25.

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Protocol

1. preparazione del D1/D2 braccio moduli22

  1. Preparazione di intermedi 2
    1. Pesare a partire del materiale 1 (illustrata nella Figura 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) in una provetta da 15 mL e sciogliere in Tris tampone (25 mM, pH 7.5) contenente Dicloruro di manganese (MnCl2, 10 mM) per ottenere una concentrazione finale glycan di 5 mM.
    2. Aggiungere 2 equivalenti di galattosio di uridina difosfato (UDP-Gal).
    3. Aggiungere 150 unità di enzima β-1, 4 galattosil transferasi da latte bovino e incubare la miscela a 37 oC per 15 h.
    4. Dopo 15 h, eseguire cromatografia su strato sottile (TLC) per indicare il consumo totale del materiale di base individuando la miscela di reazione su un piatto di TLC, sviluppare con n-butanolo/acido acetico/acqua (H2O) 1:1:1 rapporto e colorazione di un soluzione di 0,25 M cerio Ammonio molibdato seguito dal riscaldamento. Poi placare la reazione di riscaldamento a 90 oC per 5 min.
    5. Centrifugare la miscela di reazione ad una velocità di 2.737 x g per 3 min e caricare il surnatante nella parte superiore della colonna di gel di poliacrilammide (Vedi Tabella materiali). Eluire la colonna utilizzando acqua distillata deionizzata e raccogliere il prodotto con le frazioni di 1-2 mL.
    6. Monitorare la raccolta differenziata da TLC26, sviluppare con n-butanolo: H2o: acido acetico in un 1:1:1 rapporto e colorazione di una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguito dal riscaldamento. Lyophilize27 il prodotto contenente frazioni per ottenere intermedio 2 (115 mg, 86%) come polvere bianca. Caratterizzano il prodotto di NMR28 e spettroscopia di massa29 (vedere File di dati supplementari).
  2. Preparazione di intermedio 3
    1. Pesare a partire del materiale 2 (illustrato nella Figura 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0.122 mmol)) in una provetta da 15 mL e dissolverlo in Tris tampone (25 mM, pH 7.5) contenenti MnCl2 (10 mM) per preparare una concentrazione finale glycan di 5 mM.
    2. Aggiungere 2 equivalenti di sale di guanosina 5'-membrana in direzione extra-β-L-fucosio disodico (PIL-Fuc).
    3. Aggiungere 150 unità di enzima α-1, 3 fucosil transferasi da Helicobacter pylori (Hp1-3FTΔ26695) e incubare la miscela a 37 oC per 15 h.
    4. Seguire il passaggio 1.1.4.
    5. Seguire il passaggio 1.1.5.
    6. Seguire passo 1.1.6 ottenere intermedio 3 (82 mg, 84%) come polvere bianca. Caratterizzano il prodotto di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari).
  3. Preparazione di moduli 4 e 5
    1. Pesare il composto 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,230 g, 0.360 mmol) o composti 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,100 g, 0,125 mmol) in un matraccio da 25 mL singolo-collo rotondo-fondo e a secco sotto vuoto per 30 min.
    2. Rimuovere la beuta da vuoto, riempire con gas azoto, aggiungere un ancoretta magnetica, dirla con un setto di gomma e allegare un palloncino di azoto.
    3. Iniettare il pallone posizionato su un bagno di ghiaccio a 0 oC. mescolare la reazione risultante per 12 h a temperatura ambiente con un agitatore magnetico a 600-700 giri/min 7 mL di piridina asciutto e 3 mL di anidride acetica (Ac2O). Evaporare i solventi utilizzando un rotary evaporatore a una pressione di vuoto 0 - 10 mbar a 50 oC.
    4. Diluire la miscela grezza con 30 mL di diclorometano (DCM) ed estrarre con bicarbonato di sodio acquoso saturo (NaHCO3) (2 x 20 mL) in un imbuto separatore 50 mL.
    5. Ri-estrarre lo strato acquoso con DCM (3 x 15 mL) e asciugare gli strati organici combinati su solfato di sodio. Rimuovere il solfato di sodio per filtrazione e lavare con DCM (5 mL). Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 400 mbar di pressione vuoto a 40 oC.
    6. Caricare la soluzione della miscela grezza in 2 mL di DCM sopra il letto di silice.
    7. Eluire la colonna con una miscela che contiene toluene e l'acetone da 0 - 20% di acetone in toluene e raccogliere le frazioni di 5-10 mL.
    8. Monitorare la raccolta differenziata da TLC (passaggi 1.1.4 e 1.1.6), sviluppando con toluene/acetone (7/3), e che macchia con una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguiti dal riscaldamento su un piatto caldo.
    9. Evaporare il prodotto contenente frazioni utilizzando un evaporatore rotante per ottenere prodotti desiderati come schiuma bianca in 72% e 85% rendimenti, rispettivamente.
    10. Sciogliere i prodotti in 7 mL di acetonitrile: toluene: H2O un 4:2:1 rapporto in un pallone da 25 mL.
    11. Aggiungere Cerio nitrato d'ammonio (2 equivalenti) durante il raffreddamento a 0 oC con un bagno di ghiaccio. Mescolare la reazione a temperatura ambiente per 3 h a ~ 500-800 giri/min.
    12. Dopo TLC indica consumo totale del materiale di partenza (TLC sviluppando con toluene/acetone (7/3) e la visualizzazione di capacità di assorbimento UV a 254 nm o macchiando con una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguita da riscaldamento), diluire la miscela di reazione con acetato di etile (30 mL) ed estratto con H2O (15 x 2 mL).
    13. Estrarre gli strati organici combinati con 5 mL di soluzione satura di sodio cloruro (NaCl).
    14. Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 240 mbar di pressione vuoto a 40 oC.
    15. Caricare la soluzione del prodotto grezzo in 2 mL di DCM sopra il letto di silice. Eluire la colonna con una miscela che contiene toluene e l'acetone (0 - 20% di acetone in toluene) e raccogliere le frazioni di 5-10 mL. Monitorare la raccolta differenziata da TLC, sviluppando con toluene/acetone (7/3).
    16. Far evaporare le frazioni contenenti prodotto utilizzando un evaporatore rotante a vuoto mbar 77 e 40 oC per ottenere prodotti desiderati come schiume bianche.
    17. Sciogliere i rispettivi alcoli in 10 mL di DCM in un singolo-collo-25ml pallone e raffreddare a-30 oC.
    18. Aggiungi diethylaminosulfur trifluoruro (DAST, 2 equivalenti). Mescolare la miscela di reazione a-30 oC per 2 h.
    19. Dopo TLC indica il consumo di materiale di partenza (TLC sviluppando con toluene/acetone (4/1) e la visualizzazione di capacità di assorbimento UV a 254 nm o macchiando con una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguita da riscaldamento), diluire la miscela di reazione con DCM (30 mL) , e lavare con saturi NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. Estrarre lo strato organico combinato con 5 mL di soluzione satura di NaCl, asciugarlo con l'aggiunta di solfato di magnesio anidro, filtrare la miscela dopo un lavaggio con DCM (5 mL) e raccoglierlo in un pallone da 100 mL singolo-collo.
    21. Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 400 mbar di pressione vuoto a 40 oC.
    22. Caricare la soluzione del prodotto grezzo in 2 mL di DCM sopra il letto di silice. Eluire la colonna con una miscela di toluene e l'acetone (0-20% di acetone, toluene) e raccogliere le frazioni di 5-10 mL.
    23. Monitorare la raccolta differenziata da TLC, sviluppando con toluene/acetone (7/3).
    24. Evaporare il prodotto contenente frazioni utilizzando un evaporatore rotante per ottenere prodotti desiderati 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetil-α-D-mannopyranosyl fluoruro (54% superiori a 2 passi) e 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-Mannopyranosyl fluoruro (67% superiori a 2 passi) come solidi bianchi.
    25. Caratterizzano il prodotto di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari).

2. preparazione del Glycan 10

  1. Preparazione di intermedio 7
    1. Pesare il dicloruro di argento triflato (AgOTf) (0,039 g, 0,155 mmol), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0,108 mmol) in un pallone a sfondo sferico singolo-collo-25ml, asciugarlo sotto vuoto linea schlenk per 30 min, rimuoverlo dalla il vuoto e riempirlo con gas azoto.
    2. Trasferire appena secchi 4 Å setacci molecolari (0,2 g) nella beuta contenente il AgOTf e Cp2HfCl2, aggiungere un ancoretta magnetica, tappo con setto immediatamente e aggiungere un fumetto con azoto.
    3. Trasferire 3 mL di toluene asciutto nel pallone con una siringa di vetro asciutto. Mescolare la miscela di reazione per 1 h a temperatura ambiente e poi lasciare raffreddare a 0 oC.
    4. Iniettare una soluzione di donatore 4 (Figura 2, 0,043 g, 0,046 mmol) e acceptor 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (Figura 3, 0,045 g, 0,031 mmol) in 3 mL di toluene nel pallone mediante setto utilizzando una siringa da 10 mL a 0 o C. mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 3 h.
    5. Dopo TLC indica il consumo di materie prime (TLC, sviluppando con DCM/acetone (8,5/1.5) e la visualizzazione di capacità di assorbimento UV a 254 nm o macchiando con una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguita da riscaldamento), placare la reazione di iniettare 10 equivalenti di trietil ammina.
    6. Filtrare i setacci molecolari attraverso un letto di celite in un pallone a fondo rotondo da 50 mL e ulteriormente lavare con 10 mL di acetato di etile. Estrarre gli strati organici combinati con una soluzione satura di acquosa NaHCO3 (2 x 20 mL) in un imbuto separatore 50 mL. Estrarre lo strato acquoso con acetato di etile (3 x 15 mL).
    7. Estrarre gli strati organici combinati con soluzione satura di NaCl (5 mL), asciugarlo utilizzando solfato di magnesio anidro, filtrare la miscela per rimuovere il solfato di magnesio, lavare con acetato di etile (3 x 15 mL) e raccogliere il filtrato in un pallone a fondo rotondo da 100 mL.
    8. Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 240 mbar di pressione vuoto a 40 oC.
    9. Caricare la soluzione del prodotto grezzo in DCM in cima alla colonna del letto di silice. Eluire la colonna con una miscela contenente DCM e acetone (0-10% di acetone in DCM) e raccogliere le frazioni di 5-10 mL.
    10. Monitorare la raccolta differenziata da TLC, sviluppando con DCM/acetone (8,5/1.5). Far evaporare le frazioni contenenti il prodotto con un evaporatore rotante per ottenere [5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 7, intermedio 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0,052 g, 70%), come schiuma bianca.
    11. Caratterizzano il prodotto di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari).
  2. Preparazione di intermedio 8
    1. Pesare hexasaccharide 7 (Figura 3, 0,040 g, 0,016 mmol) in un pallone a sfondo sferico singolo-collo-25ml, asciugarlo sotto vuoto per 1 h, rimuoverlo dal vuoto, riempire con gas azoto, aggiungere un ancoretta magnetica e dirla con un setto di gomma.
    2. Trasferire 3 mL di acetonitrile:methanol (MeOH) (rapporto 2:1) nel pallone.
    3. Aggiungi p-toluene sulfonic acido monoidrato (0,001 g, 0.008 mmol) nel pallone di reazione e mescolare la reazione a 800 rpm per 5 h.
    4. Dopo TLC indica consumo di materiale di partenza (TLC, sviluppando con DCM/acetone (8,5/1.5) e la visualizzazione di capacità di assorbimento UV a 254 nm o macchiando con una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguita da riscaldamento), placare la reazione di iniettare 10 equivalenti di trietil ammina.
    5. Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 337 mbar di pressione vuoto a 40 oC.
    6. Sciogliere la miscela grezza con circa 2 mL di DCM e caricarlo sopra il letto di silice.
    7. Eluire la colonna con una miscela di acetone (0 - 10% di acetone in DCM) e DCM e raccogliere le frazioni di 5-10 mL. Monitorare la raccolta differenziata da TLC, sviluppando con DCM/acetone (8,5/1.5). Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 400 mbar vuoto e 40 oC.
    8. Asciugare il residuo sotto pressione ridotta per dare intermedio 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-acetil-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1 → 4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Figura 3, 0,022 g, 57%) come solido bianco. Caratterizzano il prodotto di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari).
  3. Preparazione di intermedio 9
    1. Preparazione di intermedio 9 (Figura 3) è stato realizzato utilizzando donatore 5 (0,015 g, µmol 13,2) e acceptor 8 (Figura 3, 0,020 g, 8.80 µmol).
    2. AgOTf (0,011 g, 44,1 µmol) e Cp2HfCl2 (0,012 g, 30,8 µmol) sono stati utilizzati come un promotori.
    3. Eseguire i passaggi 2.1.1 a 2.1.10 arrivare intermedio 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deossi-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as schiuma bianca.
  4. Deprotezione globale di intermedio
    1. Pesare il composto 9 (0,010 g, 2,9 µmol) in un pallone a sfondo sferico singolo-collo-25ml, aggiungere un ancoretta magnetica, tappo con un setto di gomma e allegare un palloncino di azoto.
    2. Trasferire 2 mL di 1, 4 diossano: H2O (4:1) nel pallone. Aggiungere idrossido di litio (LiOH) (0,005 g, 50% di peso) nel pallone. Mescolare la miscela di reazione a 90-100 oC per 12 h e lasciarla raffreddare a TA.
    3. Evaporare i solventi mediante un evaporatore rotante e asciugare il pallone sotto vuoto per 1 h, riempirlo con azoto, rimuoverlo dal collettore di aspirazione e dirla con un setto di gomma.
    4. Iniettare 4 mL di piridina asciutto e 2 mL di anidride acetica nel matraccio attraverso il setto con una siringa da 10 mL a 0 oC. mescolare la miscela di reazione per 12 h a TA.
    5. Evaporare i solventi mediante un evaporatore rotante a 0-10 mbar di pressione vuoto a 50 oC.
    6. Sciogliere la miscela grezza con 30 mL di soluzione DCM ed estrarre la soluzione satura acquosa NaHCO3 (2 x 20 mL) in un imbuto separatore 50 mL.
    7. Ri-estrarre lo strato acquoso con DCM (3 x 15 mL). Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante.
    8. Caricare una soluzione di prodotto in circa 2 mL di DCM sopra il letto di silice C18. Eluire la colonna con una miscela di acqua e metanolo (0 - 100% di metanolo in acqua) e raccogliere le frazioni di 5-10 mL.
    9. Raccogliere le frazioni di prodotto ed evaporare sotto pressione ridotta per ottenere il prodotto desiderato come schiuma bianca.
    10. Sciogliere il prodotto in 5 mL di metanolo asciutto in un pallone da 25 mL e dirla con un setto di gomma.
    11. Trasferire 0,1 mL di metossido di sodio (NaOMe) in metanolo e fresco a 0 oC con un bagno di ghiaccio e mescolare il composto per 12 h.
    12. Togliere il solvente mediante evaporatore rotante e asciugare il prodotto sotto alto vuoto.
    13. Sciogliere i prodotti grezzi in 5 mL di metanolo: H2o: acido acetico (6:3:1).
    14. Aggiungere idrossido di Palladio (Pd(OH)2) (50% in peso) e mescolare la reazione sotto atmosfera di idrogeno usando un palloncino di idrogeno per 15 h.
    15. Filtrare la reazione attraverso un letto di celite e lavare con 2 mL di metanolo seguiti da 2 mL di acqua dd.
    16. Evaporare i solventi mediante un evaporatore rotante.
    17. Sciogliere la miscela grezza con circa 1 mL di acqua e caricarlo sul letto del gel di poliacrilammide (Vedi Tabella materiali). Eluire il prodotto con acqua e raccogliere le frazioni di 1-2 mL.
    18. Monitorare la raccolta differenziata da TLC, sviluppare con n-butanolo: H2o: acido acetico (1:1:1).
    19. Raccogliere le frazioni di prodotto e lyophilize per ottenere il prodotto desiderato 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-( α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a polvere bianca.
    20. Caratterizzano il prodotto di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari).

3. preparazione dei glicani con coda acido fosfonico19,22

  1. Pesare i rispettivi glycan (2-5 µmol) in un pallone da 5 mL, aggiungere un ancoretta magnetica e dirla con un setto di gomma.
  2. Trasferimento di 400 µ l di dimetilformammide appena essiccato.
  3. Aggiungi [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) phosphoryl) ethoxyethoxy) carbonato di etile (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl)] (10-25 µmol, preparata in casa) per la soluzione di glycan. Mescolare il composto a 800 rpm per 5 h.
  4. Evaporare i solventi mediante un evaporatore rotante a 5-10 mbar di pressione vuoto a 40 oC.
  5. Sciogliere la miscela di reazione in 0,5 mL di acqua e caricare nella parte superiore del letto del gel di poliacrilammide (Vedi Tabella materiali). Eluire il prodotto utilizzando acqua e raccogliere le frazioni di 1-2 mL.
  6. Monitorare la raccolta differenziata di TLC26. Individuare la miscela di reazione su un piatto di TLC ed aggiungere la soluzione di macchia di 0,25 M cerio molibdato d'ammonio; seguire di riscaldamento utilizzando un piatto caldo. Raccogliere il prodotto contenente frazioni e lyophilize per ottenere il prodotto desiderato come una polvere bianca.
  7. Sciogliere il prodotto in 2 mL di acqua e aggiungere Pd (OH)2 (50% in peso). Mescolare la reazione a 800 rpm sotto atmosfera di idrogeno usando un palloncino di idrogeno per 15 h.
  8. Filtrare la reazione attraverso un letto di flusso-calcinato e lavare con 2 mL di metanolo seguiti da 2 mL di acqua distillata deionizzata. Evaporare i solventi mediante un evaporatore rotante a 300 mbar di pressione vuoto a 40 oC.
  9. Sciogliere la miscela grezza con circa 1 mL di acqua e caricarlo sul letto del gel di poliacrilammide (Vedi Tabella materiali).
  10. Eluire il prodotto con acqua e raccogliere le frazioni di 1-2 mL. Monitorare la raccolta differenziata di TLC26. Le frazioni di lyophilize (congelare il prodotto usando azoto liquido poi posto su liofilizzatori sotto vuoto) per ottenere il prodotto desiderato come una polvere bianca. Caratterizzano i prodotti di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari) con D2O come un solvente.

4. Glycan Array

  1. Preparazione di alluminio rivestito vetro diapositive (slide ACG) 19 , 20 , 22
    Nota: Fabbricazione delle diapositive in alluminio con vetro è stato fatto a Thin Film Technology Division, strumento Technology Research Center e laboratori di ricerca applicata nazionale, parco scientifico Hsinchu, Taiwan.
    1. Pack scivoli rivestiti, vuoto-seal loro per prevenire la formazione di NAO e mantenere sigillato fino a quando la reazione elettrochimica per anodizzazione superficiale.
  2. Superficie anodizzazione dell'alluminio rivestito di lastre di vetro 19 , 20 , 22
    1. Impostare l'incubatore termostatato a 4 ° C. Preparare la soluzione acquosa di acido ossalico 0.3 M e tenerlo in un bagno di ghiaccio. Prendere il becher da 500 mL, aggiungere una barra di agitatore magnetico.
    2. Trasferire l'acido ossalico 0,3 M becher da 500 mL e quindi inserire un bastoncino di 10cm lungo platino come catodo nella soluzione. Continuate a mescolare (a 300 giri/min) l'acido ossalico durante tutto il processo di anodizzazione.
    3. Girare il software tracer lab, fare clic sul pulsante "Configura" poi "funzione tensione sweep scelta." Impostare l'inizio e interrompere la tensione a 25,8 V, numero di punti a 100, rispetto a 1 e spazzare ritardo a 1.200 ms e fare clic su "ok".
    4. Fissare il lato in alluminio con vetro rivolto verso il catodo. Fare clic sul pulsante "Esegui test". Osservare la misura della corrente (~ 8-10 mA).
    5. Dopo l'anodizzazione superficiale, lavare il vetrino accuratamente con acqua distillata doppia, eliminazione dei fogli inceppati asciutto con gas azoto e quindi memorizzare in una camera di 30% di umidità relativa fino al successivo utilizzo.
  3. Fabbricazione di ACG glycan microarray 22
    1. Preparare individualmente 100 µ l di tutti i glicani monovalenti (I-XI) in glicole etilenico alla concentrazione di 10 mM.
    2. Diluire il glycan sopra con buffer di stampa (80% glicole etilenico e 20% acqua deionizzata) per effettuare una concentrazione di 100 µM.
    3. Per lo studio di etero-ligando, preparare 5 µ l di singoli XI glicani e ognuno aggiungere 5 µ l del uomo5GlcNAc2 (rapporto 1:1).
    4. Stampa microarrays di robotica pin (Vedi Tabella materiali) per la deposizione di 0,6 nL dei glicani precedentemente preparato su ACG diapositive31.
    5. Archiviare le diapositive stampate in una scatola asciutta umidità controllata prima del dosaggio di associazione.
  4. Mappatura glycan epitopi di HIV-1 anticorpo neutralizzante ampiamente PG9 22
    1. Preparare 1 mL BSA contenuta tampone PBST, 3% p/v.
    2. Preparare 70 µ l di PG9 (50 µ g/mL) in tampone PBST (BSA contenute tampone PBST, 3% p/v).
    3. Preparare 120 µ l di anticorpo secondario fluorescente tag asino anti-IgG umano (Alexa Fluor 647 coniugato) 50 µ g/mL in tampone PBST (BSA contenute tampone PBST, 3% p/v) al buio.
    4. Mix di anticorpo primario (PG9) e dell'anticorpo secondario tag fluorescente in rapporto 1:1 (da 60 µ l). Incubare gli anticorpi premiscelati per 30 min a 4 ° C.
    5. Caricare la diapositiva ACG nella camera di incubazione di diapositiva che è diviso in 16 pozzetti. Trasferire 100 µ l di anticorpi premiscelati nella matrice glycan e incubare a 4 ° C per 16 h.
    6. Dispensare fuori anticorpi premiscelati. Rimuovere la camera di incubazione di diapositiva.
    7. Lavare il vetrino in primo luogo nel buffer di PBST (PBS e 0.05% Tween-20), seguita da acqua deionizzata e spin asciutto a 2.000 x g.
    8. Aprire il software di analisi di immagine di microarray (Vedi Tabella materiali). Inserire una diapositiva con le caratteristiche allinearono rivolto verso il basso.
    9. Fare clic sul menu "Impostazioni", impostare la risoluzione dell'immagine di 5 µm per pixel e la lunghezza d'onda a 635 nm con PMT450 e potenza al 100%.
    10. Fare clic sul pulsante "scan" per avviare la diapositiva di imaging.
    11. Fare clic sull'icona "file" per salvare l'immagine di scansione in formato tif.
    12. Eseguire analisi di immagine seguendo guida32 dell'utente del software.
    13. Calcolare il totale intensità di fluorescenza e illustrare utilizzando software33 di elaborazione dell'immagine (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Qui, l'errore medio percentuale per tutti i punti dati è presentato da barre di errore.

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Representative Results

Una strategia modulare chemo-enzimatica per la sintesi di una vasta gamma di N -glicani è presentata nella Figura 1. La strategia è basata sul fatto che la diversità può essere creato all'inizio da chemio-enzimatico di sintesi dei tre moduli importanti, seguita dalla mannosilazione α-specifiche con il 3-O e/o 6-O posizione del residuo mannosio del comune trisaccaride nucleo di N- glicani. Considerando la diversità strutturale dei bi-, tri- e tetra-antennary tipo complesso N- glycan strutture, abbiamo creduto che un insieme di oligosaccharyl donatori e il ricettore di trisaccaridi core con preinstallato alchil handlecould essere utilizzato come partenza materiali per generare la diversità strutturale desiderata (Figura 1). L'applicabilità di glicosil donatori di fluoruro nella costruzione di una biblioteca di complessi glycan è stato dimostrato in precedenza21.

Per dimostrare l'efficacia della nostra strategia, una struttura isomerica bi-antennary (10, Figura 3) è stata selezionata per la sintesi. Il D1 braccio antenne 4 e D2 braccio antenne 5 di glycan 10 sono stati generati su larga scala dai metodi chemo-enzimatica. In particolare, il disaccaride acceptor 1 era enzimaticamente galattosilate utilizzando β-1, 4-galattosiltransferasi e uridina 5'-diphosphogalactose (UDP-Gal) per formare il trisaccaride 2. Accanto, l'intermedio 2 era fucosylated alle posizione GlcNAc 3 -O in presenza di α-1, 3-fucosiltransferasi da Helicobacter pylori (Hpα1, 3 FT) di permettersi il tetrasaccharide desiderato 3. Per legatura chimica al nucleo, edificio blocchi 2 e 3 erano prima peracetylated, e il riduzione fine p- metossi fenolo gruppo è stato rimosso. Infine, il fluoruro è stato installato in presenza di DAST per ottenere il desiderato moduli 4 e 5, rispettivamente (Figura 2).

Avendo in mano i moduli desiderati, successivamente si procede alla glicosilazioneO stereoselettiva 3 - 4 al nucleo trisaccaride 6 sotto catalisi di argento triflato e dicloruro di hafnocene per fornire i rispettivi hexasaccharide 7 (Figura 3). La protezione di benzilidene che mascherare 4, 6-OH è stato rimosso utilizzando catalitica p-toluene sulfonic acid (p- TSA). Approfittando della sua reattività, primaria 6-OH di 8 è stato reagito con fluoruro modulo 5 condizioni sperimentali simili per ottenere la necessaria decasaccharide 9. Finalmente, deprotezione globale è stato effettuato per ottenere glycan 10, che è stato ulteriormente caratterizzato mediante NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari).

Glicani contenente una coda di ammina PenTile all'estremità riducente sono stati modificati con acido fosfonico linker e fissati alla superficie di ACG attraverso fosfonato chimica (Figura 4). All'ultimo, HIV-1 bNAb PG9 è stato proiettato per la sua specificità glycan utilizzando matrici di omo - ed etero-glicani per dimostrare per la prima volta che PG9 ha interagito con adiacente heteroglycans nel ciclo V1/V2 di superficie gp120 di HIV-1 (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Una generale strategia modulare per la preparazione di N- glicani. (A) il numero di N- glicani generato da questa strategia che comunemente si verificano in glicoproteine umani è stimato a superare i 20.000. (B) tre tipi di moduli preparati da questo approccio chemo-enzimatica che può essere utilizzato per glycosylations α-seletive. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: sintesi di chemoenzimatica di moduli. i, UDP-galattosio, β 1, 4-GalT, 15h, 86%; ii, P.I.L.-fucose, α 1, 3-FucT, 15h, 84%; III, (1) Ac2O, piridina, RT, 12h; (1) CAN, ACN: toluene: H2O, (3) DAST, CH2Cl2,-30 oC. può: Cerio nitrato di ammonio; DAST: Trifluoruro Diethylaminosulfur.
Nomenclatura dei prodotti: 1, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-phenylacetonitril-(1→ 2)-α-D-mannopyranoside; 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside; 3, p-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deossi-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside - metossifenil; 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluoruro; 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluoruro Clicca qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: chimica glicosilazione dei moduli braccio D1/D2 al nucleo acceptor. i, 4, AgOTf, Cp2HfCl2, toluene, 4 Å MS, 0 oC a RT, 70%; ii, p- TSA, acetonitrile, RT, 57%; III, 5, AgOTf, Cp2HfCl2, toluene, 4 Å MS, 0 oC a RT, 34%; iv, (1) LiOH, 1,4-diossano: H2O; 90 oC, 12h; (2) Ac2O, piridina, 12 h; (3) NaOMe, MeOH, 12h; (4) Pd(OH)2, MeOH: H2O: HCOOH (5:3:2), H2, 36%. AgOTf: Trifluromethanesulfonate d'argento; CP2HfCl2: dicloruro di afnio Bis (ciclopentadienile), MS: setacci molecolari, nomenclatura dei prodotti: 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2- Acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-Mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-Mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosid. 8, 5-Azidopentyl - O-(2-O-acetil-3.4.6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside. 9, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-{2,3,4,6- O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-( 1→4)-O-(3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-Dglucopyranoside 10, 5- Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)(α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)- Α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Glycan immobilizzazione su una matrice ACG. (A) modificazione chimica di glycan con un acido fosfonico amminica coda coda per collegamento covalente alla diapositiva ACG attraverso fosfonato chimica. (B) distribuzione dei glicani su una superficie ACG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: analisi array Glyan. (A) strutture di N- glicani sintetici che vengono stampati su una matrice ACG. (B) analisi PG9 di associazione di glicani individuale I-XI stampato su matrice ACG (pannello di sinistra) e di miscele glycan di uomo5 mescolato con glicani I-XI (pannello di destra) con una concentrazione di 100 µM. Le concentrazioni molari in µM per PG9 sono date nella legenda. L'intensità media del segnale e l'errore standard calcolata per cinque repliche indipendenti sull'array sono mostrati. Inserti in Mostra immagini di fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Una classe di HIV-1 bNAbs tra cui PG9, PG16 e PGTs 128, 141-145 sono stati segnalati per essere altamente potente nel neutralizzare il 70-80% del circolante isolati HIV-1. Gli epitopi di questi bNAbs sono altamente conservati tra le varianti del gruppo intero di HIV-1 M, quindi si può guidare la progettazione immunogen efficace per un vaccino contro l'HIV suscitare anticorpi neutralizzanti23,24,25 . Come parte dei nostri sforzi per identificare gli epitopi glycan di HIV-1 largamente neutralizzando gli anticorpi, abbiamo riportato la sintesi chimica ed enzimatica di un panel di alta mannosio, ibrido e oligosaccaridi di tipo complesso per formare un glycan array21, 22. Tuttavia, le matrici di glycan comunemente utilizzati su vetrini N- Idrossisuccinimide-rivestito (NHS) sono in grado di rilevare interazioni di carboidrati e proteine di bassa affinità, probabilmente a causa di distribuzione eterogenea glycan derivanti dall'idrolisi di reattive N- hydroxysuccimide gruppi funzionali sulla sua superficie. Per superare i limiti dei formati di matrice convenzionale, abbiamo sviluppato una matrice glycan su uno scivolo di ossido di alluminio vetro verniciati (ACG). Abbiamo ulteriormente effettuato un confronto di omogeneità tra la matrice ACG e il NHS comunemente utilizzato matrice per dimostrare che la matrice ACG offerto una presentazione glycan più omogenea sulla sua superficie22. La nostra analisi preliminare vincolante non era in grado di osservare associazione PG9 per uno qualsiasi dei glicani su matrice di NHS (dati non mostrati). Pertanto, per definire la specificità di legame PG9, glicani I-XI erano collegati a una coda di acido fosfonico e stampato sulla diapositiva ACG con 100 µM di glicani individuali (Figura 4). L'immobilizzazione glycan su uno scivolo ACG attraverso fosfonato chimica offerto una distribuzione più stabile ed omogenea. Ciascuno dei glicani è stato stampato con cinque ripetizioni e immagini delle diapositive sono state ottenute da una scansione di fluorescenza dopo incubazione dell'anticorpo coniugato DyLight649 asino anti-umano IgG. L'analisi di associazione PG9 verso singoli glicani stampato su matrice ACG (Figura 5, pannello di sinistra) suggerisce che PG9 interagito fortemente con glycan di tipo ibrido (X). Le interazioni sono state rilevate anche per tipo di alta mannosio Man5 (glycan IV) e il complesso tipo glycan (XI).

Le interazioni molecolari di livello tra glycan PG9 e tipo ibrido (X) sono difficili da determinare a causa della mancanza delle loro informazioni di struttura di co-cristallo. Il tipo ibrido glycan X è composto da un braccio di tipo complesso ai 3-posizioneO dell'anima e un braccio trimannose collegato al 6-O posizione del trisaccaride centrale. Associazione PG9 per ibrido glycan X suggerisce che PG9 richiede sia mannosio e acido sialico residui nelle vicinanze per le interazioni di alta affinità. Per identificare la combinazione glycan che meglio si adatta in tasca associazione PG9, abbiamo effettuato uno studio di matrice mista-glycan. Glycan IV è stato mescolato con ogni glycan da XI in un rapporto di 1:1 mole e macchiato su una matrice ACG. L'analisi di associazione PG9 per ognuna delle miscele ha indicato che una combinazione di uomo5 e un SCT (IV + XI) ha provocato il più alta affinità verso PG9 rispetto al IV o XI da solo. Inoltre, miscele contenenti Man5 e quelli contenenti sialilato antenne come glicani VIII e X sono stati anche rilevati22. Per la prima volta, questi risultati ha offerto una prova di matrice basata per comportamento di associazione degli Etero-glicani PG9 che è stato suggerito da studi di struttura di cristallo PG9 con il HIV-1 gp120 V1/V2 dominio23.

In conclusione, abbiamo dimostrato un'efficace strategia di chemo-enzimatica modulare per la preparazione di diversissimo N-collegato oligosaccaridi che si verificano in glicoproteine umane. Inoltre, lo sviluppo di una matrice ACG fornisce che un mezzo efficace per determinare interazioni proteine-carboidrati estremamente debole e, soprattutto, le interazioni che avvengono attraverso etero-glicani.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Thin Film Technology Division, strumento Technology Research Center (ITRC) e laboratori di ricerca applicata nazionale, parco scientifico Hsinchu, Taiwan. Questo lavoro è stato supportato dal National Science Council (grant no. La maggior parte 105-0210-01-13-01) e Academia Sinica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Chemio-enzimatico di sintesi chimica problema 132 matrici ACG glycan HIV neutralizzando gli anticorpi N- glicani specificità profilatura approccio modulare
Chemio-enzimatico di sintesi della <em>N</em>- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura
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Shivatare, S. S., Shivatare, V. S.,… More

Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C. Y., Wong, C. H. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).

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