Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Chemo-enzymatisk syntese av N- glykaner for matrisen utvikling og HIV antistoff profilering

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/55855
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Summary

En modulær tilnærming til syntesen av N- glykaner for å feste til en aluminiumoksid-belagt glass skyve (ACG lysbilde) som en glycan microarray er utviklet og bruk for profilering av en HIV bredt nøytralisere antistoffer har vist.

Abstract

Vi presenterer en svært effektiv måte for rask utarbeidelse av et bredt spekter av N-koblet oligosaccharides (estimert overstiger 20.000 strukturer) som ofte finnes på menneskelig glykoproteiner. For å oppnå ønsket strukturelle mangfoldet, strategien begynte med kjemoterapi-enzymatisk syntesen av tre typer oligosaccharyl fluor moduler, etterfulgt av deres gradvis α-selektiv glycosylations på den 3-O og 6-O stillinger på den mannose rester av den felles kjerne trisaccharide har en avgjørende β-mannoside kobling. Vi ytterligere knyttet N- glykaner på overflaten av en aluminiumoksid-belagt (ACG) objektglass opprette en kovalente blandet matrise for analyse av hetero-ligand interaksjon med et HIV antistoff. Spesielt type bindingsmåte av en nylig isolert HIV-1 bredt nøytraliserende antistoff (bNAb), PG9, blandingen av tett linjeavstand mann5GlcNAc2 (mann5) og 2,6-di-sialylated bi-antennary kompleks N- glycan (SCT ) på en ACG matrise, åpner en ny vei å veilede effektiv immunogen design for HIV vaksineutvikling. I tillegg bærer våre ACG matrise et kraftig verktøy for å studere andre HIV antistoffer hetero-ligand binding oppførsel.

Introduction

N- glykaner på glykoproteiner kobles covalently til asparagine (Asn) rester av konsensus Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, som påvirker flere biologiske prosesser som protein konformasjon, antigenicity, løselighet og Lektiner anerkjennelse 1 , 2. kjemisk syntesen av N-koblede oligosaccharides representerer en betydelig syntetiske utfordring på grunn av deres store strukturelle mikro heterogenitet og svært forgrenet arkitektur. Nøye utvalgte beskytte grupper for å tune reaktivitet av byggeklosser, oppnå selektivitet anomeric sentre, og riktig bruk av arrangøren / activator(s) er viktige elementer i syntesen av komplekse oligosaccharides. For å løse dette problemet med kompleksiteten, en god mengde arbeid å fremme N- glycan syntese ble rapportert nylig3,4. Til tross for disse robust tilnærminger, finne en effektiv metode for utarbeidelse av en rekke N- glykaner (~ 20 000) fortsatt en stor utfordring.

Rask Mutasjonshastigheten av HIV-1 omfattende genetisk mangfold og dens evne til å flykte fra nøytralisere antistoffet svaret, er blant de største utfordringene å utvikle en sikker og forebyggende vaksine mot HIV-15,6 , 7. en effektiv taktikk som HIV bruker å unngå immunrespons vert er den post-translasjonell glykosylering av konvolutten glykoprotein gp120 med en variert N-koblet glykaner avledet fra verten glykosylering maskiner8, 9. En fersk rapport om nøyaktig analyse av rekombinant monomerisk HIV-1 gp120 glykosylering fra menneskelige embryonale (HEK) 293T nyreceller antyder forekomsten av strukturelle microheterogeneity med en karakteristisk celle-spesifikke mønster10 , 11 , 12. derfor forståelse glycan særegenheter av HIV-1 bNAbs krever også preget gp120 knyttet N- glycan strukturer i et antall tilstrekkelig for analyse.

Oppdagelsen av glycan microarray teknologi gitt høy gjennomstrømming-baserte utforskning av spesifisiteter av en rekke ulike karbohydrat-bindende proteiner, virus/bakteriell adhesins, toksiner, antistoffer og lectines13,14 . Systematisk glykaner ordningen i et plassert chip-basert format kan fastslå problematisk lav affinitet protein-glycan vekselsvirkningene gjennom multivalent presentasjon15,16,17,18. Chip-baserte glycan ordningen beleilig vises å etterligne effektivt celle-celle grensesnitt. Å berike teknologien og overvinne ujevn spørsmålet forbundet med konvensjonelle matrise formater, utviklet vår gruppe nylig et glycan utvalg på aluminiumoksid-belagt glass (ACG) lysbilder med phosphonic syre-slutt glykaner for å forbedre signal intensiteten, homogenitet og følsomhet19,20.

For å forbedre gjeldende forståelse glycan epitopes nylig isolert HIV-1 bredt nøytralisere antistoffer (bNAbs), har vi utviklet en svært effektive modulbaserte strategi for utarbeidelse av en rekke N-koblet glykaner21 ,22 skal skrives ut på en ACG Skyv (se figur 1). Spesifisitet profilering studier av HIV-1 bNAbs på tabelldata ACG tilbys uvanlig påvisning av hetero-glycan binding virkemåten til svært potent bNAb PG9 som ble isolert fra HIV infisert enkeltpersoner23,24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av D1/D2 Arm moduler22

  1. Utarbeidelse av mellomtid 2
    1. Veie starter materiale 1 (vist i figur 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) i en 15 mL tube og løses i Tris buffer (25 mM, pH 7.5) som inneholder mangan dichloride (MnCl2, 10 mM) for å oppnå en siste glycan konsentrasjon av 5 mM.
    2. Legg 2 ekvivalenter av uridine diphosphate galaktose (UDP-Gal).
    3. Tilsett 150 enheter av enzymet β-1, 4 galactosyl transferases fra storfe melk, og ruge blandingen på 37 oC 15 h.
    4. Etter 15 h, utføre tynt lag kromatografi (TLC) for å angi Totalforbruk starter materiale ved å fange reaksjonsblandingen på en TLC plate, utvikle med n-butanol/eddiksyre/vann (H2O) i 1:1:1 ratio og flekker av en løsning av 0,25 M cerium ammonium molybdate etterfulgt av oppvarming. Deretter slukke reaksjonen ved 90 oC i 5 min.
    5. Sentrifuge reaksjonsblandingen med en hastighet på 2,737 x g i 3 minutter, og legger nedbryting på toppen av polyakrylamid gel kolonne (se Tabell for materiale). Elute kolonnen bruker destillert de-ionisert vann, og samle produktet med fraksjoner av 1-2 mL.
    6. Overvåke samlet fraksjoner av TLC26, med n-butanol: H2O: eddiksyre i en 1:1:1 forhold og flekker av en løsning av cerium ammonium molybdate etterfulgt av oppvarming. Lyophilize27 produktet inneholder brøker for å få mellomtid 2 (115 mg, 86%) som hvitt pulver. Beskrive produktet av NMR28 og masse spectroscopy29 (se utfyllende datafilen).
  2. Utarbeidelse av mellomliggende 3
    1. Veie starter materiale 2 (vist i figur 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0.122 mmol)) i en 15 mL tube og oppløse den i Tris buffer (25 mM, pH 7.5) som inneholder MnCl2 (10 mM) å forberede en endelig glycan konsentrasjon av 5 mM.
    2. Legg 2 tilsvarende guanosine 5-diphospho-β-L-fucose disodium salt (BNP-Fuc).
    3. Tilsett 150 enheter av enzymet α-1, 3 fucosyl transferases fra Helicobacter pylori (Hp1-3FTΔ26695), og ruge blandingen på 37 oC 15 h.
    4. Følg trinn 1.1.4.
    5. Følg trinn 1.1.5.
    6. Følg trinn 1.1.6 hente mellomliggende 3 (82 mg, 84%) som hvitt pulver. Beskrive produktet av NMR og masse spektroskopi (se utfyllende datafiler).
  3. Utarbeidelse av moduler 4 og 5
    1. Veie sammensatte 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.230 g, 0.360 mmol) eller sammensatte 3 p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.100 g, 0.125 mmol) i en 25 mL single-hals runde bunn kolbe og tørr under vakuum i 30 min.
    2. Fjern flasken fra vakuum, fylle den med nitrogen gass, legge en magnetic røre bar, cap det med en gummi septum og feste en nitrogen ballong.
    3. Injisere 7 mL av tørre pyridine og 3 mL av eddiksyre (Ac2O) i flasken plassert på en isbadet på 0 oC. rør resulterende reaksjonen 12 h ved romtemperatur med en magnetisk rørestang på 600-700 rpm. Fordampe løsemidlene bruker en roterende fordamperen ved vakuum trykk 0 - 10 mbar på 50 oC.
    4. Fortynne råolje blandingen med 30 mL av diklormetan (DCM) og pakke med mettet vandig natrium hydrogen karbonat (NaHCO3) (2 x 20 mL) i en 50 mL separatory trakt.
    5. Pakk vandig laget med DCM (3 x 15 mL) og tørr kombinert organiske lagene over natrium sulfat. Fjerne sodium sulfate ved filtrering og vask med DCM (5 mL). Fordampe løsemiddelet bruker en roterende fordamperen på 400 mbar tomrommet trykket på 40 oC.
    6. Legg løsning av olje blanding i 2 mL DCM over silica sengen.
    7. Elute kolonnen med en blanding som inneholder toluen og aceton fra 0 - 20% aceton i toluen og samle fraksjoner av 5-10 mL.
    8. Overvåke samlet fraksjoner av TLC (trinn 1.1.4 og 1.1.6), med toluen/aceton (7/3), og flekker med en løsning på cerium ammonium molybdate etterfulgt av oppvarming på en kokeplate.
    9. Fordampe produktet inneholder brøker med en roterende fordamperen få ønskede produktene som hvitt skum i 72% og 85% avkastning, henholdsvis.
    10. Oppløses produktene i 7 mL av acetonitrile: Toluen: H2O i en 4:2:1-forhold i en 25 mL runde bunn kolbe.
    11. Legg cerium ammoniumnitrat (2 ekvivalenter) mens nedkjøling til 0 oC bruker en isbadet. Rør reaksjonen ved romtemperatur for 3 h ~ 500-800 RPM.
    12. Etter TLC angir Totalforbruk starter materiale (TLC med toluen/aceton (7/3) og visualisering av UV absorbans ved 254 nm eller flekker med en løsning på cerium ammonium molybdate etterfulgt av oppvarming), fortynne reaksjonsblandingen med Ethyl acetate (30 mL) og pakke med H2O (15 x 2 mL).
    13. Ekstra kombinert organiske lagene med 5 mL mettet natriumklorid (NaCl).
    14. Fordampe løsemiddelet bruker en roterende fordamperen på 240 mbar tomrommet trykket på 40 oC.
    15. Legg løsning av råolje produktet i 2 mL DCM over silica sengen. Elute kolonnen med en blanding som inneholder toluen og aceton (0 - 20% aceton i toluen) og samle fraksjoner av 5-10 mL. Overvåke samlet fraksjoner av TLC, med toluen/aceton (7/3).
    16. Fordampe produktet inneholder fraksjoner med en roterende fordamperen på 77 mbar vakuum og 40 oC for å få ønsket produkter som hvitt skum.
    17. Oppløses respektive alkoholer i 10 mL DCM 25 mL single-hals runde bunn kolbe og kult å-30 oC.
    18. Legge til diethylaminosulfur trifluoride (DAST, 2 ekvivalenter). Rør reaksjonsblandingen på-30 oC 2 h.
    19. Etter TLC angir forbruk av starter materiale (TLC med toluen/aceton (4/1) og visualisering av UV absorbans ved 254 nm eller flekker med en løsning på cerium ammonium molybdate etterfulgt av oppvarming), fortynne reaksjonsblandingen med DCM (30 mL) , og vask med mettet NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. Ekstra kombinert organisk laget med 5 mL mettet NaCl, tørk den ved å legge vannfri magnesium sulfat, filtrere blandingen etter en vask med DCM (5 mL), og samle den i en 100-mL single-hals runde bunn kolbe.
    21. Fordampe løsemiddelet bruker en roterende fordamperen på 400 mbar tomrommet trykket på 40 oC.
    22. Laste løsning av råolje produktet i 2 mL DCM over silica sengen. Elute kolonnen med en blanding av toluen og aceton (0-20% aceton i toluen) og samle fraksjoner av 5-10 mL.
    23. Overvåke samlet fraksjoner av TLC, med toluen/aceton (7/3).
    24. Fordampe produktet inneholder brøker bruker en roterende fordamperen for å få ønskede produktene 4 [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluorid (54% over 2 skritt) og 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluor (67% over 2 trinn) som hvit faste stoffer.
    25. Beskrive produktet av NMR og masse spektroskopi (se utfyllende datafiler).

2. forberedelse av Glycan 10

  1. Utarbeidelse av intermidiate 7
    1. Veie sølv triflate (AgOTf) (0.039 g, 0.155 mmol), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride (Cp2HfCl2) (0.041 g, 0.108 mmol) i en 25-mL single-hals runde bunn kolbe, tørk den under schlenk linje vakuum i 30 min, fjerne den fra den vakuum, og fyll den med nitrogen gass.
    2. Overføre de ferske tørket 4 Å molekylær sikter (0.2 g) i flasken som inneholder de AgOTf og Cp2HfCl2, Legg en magnetic røre bar, lue med septum umiddelbart, og Legg en nitrogen ballong.
    3. Overføre 3 mL tørr toluen i flasken med en tørr glass sprøyte. Rør reaksjonsblandingen 1t ved romtemperatur og kjøle 0 oC.
    4. Injisere en løsning av donor 4 (figur 2, 0.043 g, 0.046 mmol) og acceptor 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (Figur 3, 0.045 g, 0.031 mmol) i 3 mL toluen i flasken gjennom septum bruker en 10 mL sprøyte på 0 o C. rør reaksjonsblandingen ved romtemperatur for 3t.
    5. Etter TLC angir forbruk av starter materialer (TLC, utvikle med DCM/aceton (8.5/1.5) og visualisering av UV absorbans ved 254 nm eller flekker med en løsning på cerium ammonium molybdate etterfulgt av oppvarming), slukke reaksjonen av sprøytebruk 10 tilsvarer triethyl Amin.
    6. Filtrere de molekylære sikter gjennom en celite seng i en 50-mL rund bunn kolbe, og ytterligere vask med 10 mL ethyl acetate. Ekstra kombinert organiske lagene med en mettet løsning av vandig NaHCO3 (2 x 20 mL) i en 50 mL separatory trakt. Ekstra vandig laget med ethyl acetate (3 x 15 mL).
    7. Ekstra kombinert organiske lagene med mettet NaCl løsning (5 mL), tørk den ved hjelp av vannfri magnesium sulfat, filtrere blandingen til å fjerne magnesium-sulfat, vaske med ethyl acetate (3 x 15 mL) og samle filtratet i en 100-mL rund bunn kolbe.
    8. Fordampe løsemiddelet bruker en roterende fordamperen på 240 mbar tomrommet trykket på 40 oC.
    9. Laste løsning av råolje produktet i DCM over kolonnen silica seng. Elute kolonnen med en blanding som inneholder DCM og aceton (0-10% aceton i DCM) og samle fraksjoner av 5-10 mL.
    10. Overvåke samlet fraksjoner av TLC, med DCM/aceton (8.5/1.5). Fordampe fraksjoner som inneholder produktet bruker en roterende fordamperen for å få intermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[ 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0.052 g, 70%), som hvitt skum.
    11. Beskrive produktet av NMR og masse spektroskopi (se utfyllende datafiler).
  2. Utarbeidelse av intermidiate 8
    1. Veie hexasaccharide 7 (Figur 30.040 g, 0.016 mmol) i en 25-mL single-hals runde bunn kolbe, tørk den under vakuum 1t, fjerne den fra vakuum, fylle den med nitrogen gass, legge en magnetic røre bar og cap det med en gummi septum.
    2. Overføre 3 mL acetonitrile:methanol (MeOH) (2:1 ratio) i flasken.
    3. Legge til p-toluen sulfonsyre monohydrat (0,001 g, 0.008 mmol) i reaksjon kolbe og røre reaksjonen på 800 rpm for 5 h.
    4. Etter TLC angir comsumption starter materiale (TLC, utvikle med DCM/aceton (8.5/1.5) og visualisering av UV absorbans ved 254 nm eller flekker med en løsning på cerium ammonium molybdate etterfulgt av oppvarming), slukke reaksjonen av sprøytebruk 10 tilsvarer triethyl Amin.
    5. Fordampe løsemiddelet bruker en roterende fordamperen på 337 mbar tomrommet trykket på 40 oC.
    6. Oppløse råolje blandingen med ca 2 mL DCM og laste det over silica sengen.
    7. Elute kolonnen med en blanding av DCM og aceton (0 - 10% aceton i DCM) og samle fraksjoner av 5-10 mL. Overvåke samlet fraksjoner av TLC, med DCM/aceton (8.5/1.5). Fordampe løsemiddelet bruker en roterende fordamperen på 400 mbar vakuum og 40 oC.
    8. Tørr rester under redusert press for å gi middels 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-acetyl-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Figur 30.022 g, 57%) som en hvit solid. Beskrive produktet av NMR og masse spektroskopi (se utfyllende datafiler).
  3. Utarbeidelse av intermidiate 9
    1. Utarbeidelse av intermidiate 9 (Figur 3) ble gjort ved hjelp av donor 5 (0.015 g, 13,2 µmol) og acceptor 8 (Figur 30.020 g, 8.80 µmol).
    2. AgOTf (0.011 g, 44.1 µmol) og Cp2HfCl2 (0.012 g, 30,8 µmol) ble brukt som en promoterere.
    3. Fremgangsmåten 2.1.1 til 2.1.10 å få mellomliggende 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as hvitt skum.
  4. Globale deprotection av intermidiate
    1. Veie sammensatte 9 (0,010 g, 2,9 µmol) i en 25-mL single-hals runde bunn kolbe, legge til en magnetic røre bar, lue med en gummi septum, og koble en nitrogen ballong.
    2. Overføre 2 mL 1, 4 dioxane: H2O (4:1) i flasken. Legge til litium hydroksid (LiOH) (0.005 g, 50% av wt.) i flasken. Rør reaksjonsblandingen på 90-100 oC 12 h og la den avkjøles på RT.
    3. Fordampe løsemidlene bruker en roterende fordamperen og tørr kolbe under vakuum 1t, fylle den med nitrogen, fjerne den fra vakuum manifolden og cap det med en gummi septum.
    4. Injisere 4 mL av tørre pyridine og 2 mL av eddiksyre i flasken gjennom septum bruker en 10 mL sprøyte på 0 oC. rør reaksjonsblandingen for 12 h på RT.
    5. Fordampe løsemidlene bruker en roterende fordamperen på 0-10 mbar tomrommet trykket på 50 oC.
    6. Oppløse råolje blandingen med 30 mL DCM og ekstra løsningen med mettet vandig NaHCO3 (2 x 20 mL) i en 50 mL separatory trakt.
    7. Pakk vandig laget med DCM (3 x 15 mL). Fordampe løsemiddelet bruker en roterende fordamperen.
    8. Laste inn en løsning av produktet i ca 2 mL DCM over C18 silica sengen. Elute kolonnen med en blanding av vann og metanol (0 - 100% av metanol i vann) og samle fraksjoner av 5-10 mL.
    9. Samle produktet fraksjoner og fordampe under redusert press for å få ønsket produkt som hvitt skum.
    10. Oppløses produktet i 5 mL av tørr metanol i en 25 mL rundt bunnen kolbe og cap det med en gummi septum.
    11. Overføre 0,1 mL av natrium methoxide (NaOMe) i metanol og kule 0 oC bruker en isbadet og rør blandingen for 12 h.
    12. Fjerne løsemiddelet bruker en roterende fordamperen og tørr produktet under høy vakuum.
    13. Oppløse råolje produkter i 5 mL av metanol: H2O: eddiksyre (6:3:1).
    14. Legge til palladium hydroksid (Pd(OH)2) (50% av wt) og rør reaksjonen under hydrogen atmosfære bruker en hydrogen ballong 15 h.
    15. Filtrere reaksjonen gjennom en celite seng og vask med 2 mL metanol etterfulgt av 2 mL dd vann.
    16. Fordampe løsemidlene bruker en roterende fordamperen.
    17. Oppløse råolje blandingen med ca 1 mL vann og laste det over polyakrylamid gel sengen (se Tabell for materiale). Elute produktet med vann og samle fraksjoner av 1-2 mL.
    18. Overvåke samlet fraksjoner av TLC, utvikle med n-butanol: H2O: eddiksyre (1:1:1).
    19. Samle produktet fraksjoner og lyophilize for å få ønsket produkt 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-( α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a hvitt pulver.
    20. Beskrive produktet av NMR og masse spektroskopi (se utfyllende datafiler).

3. forberedelse av glykaner med Phosphonic syre hale19,22

  1. Veie den respektive glycan (2-5 µmol) i en 5 mL runde bunn bolle, Legg magnetic røre bar og cap det med en gummi septum.
  2. Overføre 400 µL av fersk tørket vannistedenfor.
  3. Legg til [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) phosphoryl) ethoxyethoxy) etyl (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl) karbonat] (10-25 µmol, utarbeidet i huset) til glycan løsning. Rør blandingen på 800 rpm for 5 h.
  4. Fordampe løsemidlene bruker en roterende fordamperen på 5-10 mbar tomrommet trykket på 40 oC.
  5. Oppløse reaksjonsblandingen i 0,5 mL vann og laste øverst i polyakrylamid gel sengen (se Tabell for materiale). Elute produktet bruker vann og samle fraksjoner av 1-2 mL.
  6. Overvåke samlet fraksjoner av TLC26. Spot reaksjonsblandingen på en TLC plate, og Legg til flekk løsning av 0,25 M cerium ammonium molybdate; følge av oppvarming med en kokeplate. Samle produktet inneholder brøker og lyophilize for å få det ønskede produktet som et hvitt pulver.
  7. Oppløse produktet i 2 mL vann og legge Pd (OH)2 (50% av vekten). Rør reaksjonen på 800 rpm under hydrogen atmosfære bruker en hydrogen ballong 15 h.
  8. Filtrere reaksjonen gjennom en flux-også brent seng og vask med 2 mL metanol etterfulgt av 2 mL destillert de-ionisert vann. Fordampe løsemidlene bruker en roterende fordamperen på 300 mbar tomrommet trykket på 40 oC.
  9. Oppløse råolje blandingen med ca 1 mL vann og laste det over polyakrylamid gel sengen (se Tabell for materiale).
  10. Elute produktet med vann og samle fraksjoner av 1-2 mL. Overvåke samlet fraksjoner av TLC26. Lyophilize fraksjoner (fryse produktet med flytende nitrogen og plasser på lyophilizer under et vakuum) å få det ønskede produktet som et hvitt pulver. Karakterisere varer NMR og masse spektroskopi (se utfyllende datafiler) bruker D2O som et løsemiddel.

4. Glycan matrise

  1. Utarbeidelse av aluminium belagt glass lysbilder (ACG lysbilde) 19 , 20 , 22
    Merk: Fabrikasjon av aluminium-belagt glass lysbilder ble gjort på tynn Film Technology Division, Instrument Technology Research Center og nasjonale anvendt forskningslaboratorier, Hsinchu Science Park, Taiwan.
    1. Pakke belagt lysbilder, vakuum-forsegling dem å forhindre dannelsen av NAO, og holde forseglet inntil elektrokjemisk reaksjon til overflaten anodization.
  2. Overflate anodization av aluminium belagt glass lysbilder 19 , 20 , 22
    1. Angi temperaturkontrollert inkubator på 4 ° C. Forberede 0,3 M oksalsyre vandig løsning og holde den i en isbadet. Ta 500 mL begeret, legge til en magnetisk rørestang bar.
    2. Overføre oksalsyre 0,3 M til 500 mL begeret, og Plasser en 10 cm lang platina stang som en katode i løsningen. Holder gripende (på 300 rpm) oksalsyre gjennom hele anodization prosessen.
    3. Slå på lab tracer programvare, klikk på "satt opp" knappen deretter "fungere valg feie spenning." Angi start og stopp spenning til 25.8 V, antall poeng til 100, samsvar til 1, og feie forsinkelse til 1200 ms og klikk "ok."
    4. Klemme på aluminium-belagt glass vendt mot katoden. Klikk "Kjør test" knapp. Observere gjeldende måling (~ 8-10 mA).
    5. Etter overflate anodization, vaske lysbildet grundig med dobbel destillert vann, tømme tørr med nitrogen gass og deretter lagre i en 30% relativ fuktighet kammer til videre bruk.
  3. Fabrikasjon av ACG glycan microarray 22
    1. Forberede 100 µL av alle monovalent glykaner (I-XI) i etylenglykol på 10 mM konsentrasjon individuelt.
    2. Fortynne den ovenfor glycan med utskrift buffer (80% etylenglykol og 20% de-ionisert vann) for å gjøre 100 µM konsentrasjon.
    3. Forberede 5 µL av personlige jeg-XI glykaner hetero-ligand studien, og hver legge 5 µL av mann5GlcNAc2 (1:1 ratio).
    4. Skrive ut microarrays av robot pin (se Tabell for materiale) av avsetning av 0,6 nL av den tidligere forberedt glykaner på ACG lysbilder31.
    5. Lagre de utskrevne lysbildene i en fuktighet kontrollert tørr boks før bindende analysen.
  4. Tilordne glycan epitopes HIV-1 bredt nøytraliserende antistoff PG9 22
    1. Forberede 1 mL BSA inneholdt PBST buffer, 3% w/v.
    2. Forberede 70 µL av PG9 (50 µg/mL) PBST buffer (BSA inneholdt PBST buffer, 3% w/v).
    3. Forberede 120 µL sekundære fluorescerende tag antistoff esel anti-IgG (Alexa Fluor 647 konjugert) 50 µg/mL PBST buffer (BSA inneholdt PBST buffer, 3% w/v) i mørket.
    4. Bland primære antistoff (PG9) og sekundær fluorescerende tag antistoff 1:1 ratio (60 µL hver). Inkuber ferdigblandet antistoffer i 30 min på 4 ° C.
    5. Legg ACG lysbildet i lysbildet inkubasjon kammeret som er inndelt i 16 brønner. Overføre 100 µL av ferdigblandet antistoffer til glycan array og ruge på 4 ° C 16 h.
    6. Pipetter ut ferdigblandet antistoffer. Fjerne lysbilde inkubasjon kammeret.
    7. Vask lysbildet først i PBST buffer (PBS og 0,05% Tween-20), etterfulgt av de-ionisert vann og spinn tørr 2000 x g.
    8. Åpne microarray bildet analyseprogramvare (se Tabell for materiale). Sette inn et lysbilde med plassert som vender ned.
    9. Klikk på "innstillinger"-menyen, angi bildeoppløsningen 5 µm per piksel, og bølgelengde på 635 nm med PMT450 og kraften til 100%.
    10. Klikk på knappen "scan" å starte imaging lysbildet.
    11. Klikk "fil"-ikonet for å lagre skanne bildet i tif-format.
    12. Utføre bildeanalyser etter programvare brukerens guide32.
    13. Beregne totale intensiteten av fluorescens og illustrere bruke bildebehandling programvare33 (se Tabell for materiale).
      Merk: Her, den gjennomsnittlige prosentandelen feilen for alle datapunkter presenteres av feilfelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En modulær chemo-enzymatisk strategi for syntesen av en rekke N -glykaner vises i figur 1. Strategien er basert på det faktum at mangfold kan opprettes i begynnelsen av kjemoterapi-enzymatisk syntese av tre viktige modulene, etterfulgt av α-spesifikke mannosylation på den 3-O og/eller 6-O posisjon mannose restene av felles Core trisaccharide av N- glykaner. Vurderer strukturelle mangfoldet av bi-, tre- og tetra-antennary kompleks type N- glycan strukturer trodde vi at en rekke oligosaccharyl givere og core trisaccharides acceptor med forhåndsinstallerte alkyl handlecould brukes som starter materialer til å generere ønsket strukturelle mangfoldet (figur 1). Anvendelse av glycosyl fluor givere i å bygge et kompleks glycan bibliotek har vist tidligere21.

For å demonstrere effektiviteten av vår strategi, ble en bi-antennary isomere struktur (10, Figur 3) valgt for syntese. D1 arm antenner 4 og D2 arm antenner 5 glycan 10 ble generert på store skalaer av kjemoterapi-enzymatisk metoder. Spesielt var smakløst acceptor 1 enzymatisk galactosylated ved hjelp av β-1, 4-galactosyltransferase og uridine 5'-diphosphogalactose (UDP-Gal) til trisaccharide 2. Neste, den mellomliggende 2 var fucosylated på GlcNAc 3 -O posisjon i nærvær av α-1, 3-fucosyltransferase fra Helicobacter pylori (Hpα1, 3 FT) råd til ønsket tetrasaccharide 3. Kjemisk ligation kjernen, byggesteinene 2 og 3 var første peracetylated og redusere slutten p- methoxy fenol gruppen ble fjernet. Til slutt, fluor ble installert i nærvær av DAST å få ønsket moduler 4 og 5, henholdsvis (figur 2).

Har ønsket modulene i hånden, fortsetter vi neste til stereoselektiv 3 -O glykosylering 4 til kjernen trisaccharide 6 under katalyse av sølv triflate og hafnocene dichloride å gi den respektive hexasaccharide 7 (Figur 3). Benzylidene beskyttelse at maskering 4, 6-OH ble fjernet bruker katalytisk p-toluen sulfonsyre (p- TSA). Utnytter sine reaktivitet, primære 6-OH 8 var reagert med fluor modul 5 under lignende eksperimentelle forhold å oppnå den nødvendige decasaccharide 9. Endelig, ble globale deprotection utført for å få glycan 10, som ble ytterligere preget NMR og masse spektroskopi (se utfyllende datafilen).

Glykaner inneholder en pentyl Amin hale på redusere slutten ble endret med phosphonic syre linkers og tilknyttet ACG overflaten gjennom phosphonate kjemi (Figur 4). På siste, HIV-1 bNAb ble PG9 vist for sin glycan spesifisitet bruker homo - og hetero-glykaner matriser for å demonstrere for første gang PG9 interaksjon med tilstøtende heteroglycans i V1/V2 loop av HIV-1 gp120 overflate (figur 5).

Figure 1
Figur 1: En generell modulære strategi for utarbeidelse av N- glykaner. (A) antall N- glykaner generert av denne strategien som ofte oppstår på menneskelig glykoproteiner anslås for å overstige 20 000. (B) tre typer moduler utarbeidet av dette chemo-enzymatisk tilnærming som kan brukes til α-seletive glycosylations. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Chemoenzymatic syntese av moduler. Jeg, UDP-galaktose, β 1, 4-GalT, 15 h, 86%. ii, BNP-fucose, α 1, 3-FucT, 15 h, 84%. III, (1) Ac2O, pyridine, RT, 12 h; (1) kan ACN: Toluen: H2O, (3) DAST, lm2Cl2-30 oC. kan: Cerium ammoniumnitrat; DAST: Diethylaminosulfur trifluoride.
Produktet nomenklatur: 1, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→ 2)-α-D-mannopyranoside; 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside; 3, p-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside - methoxyphenyl; 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluor; 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluor Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kjemiske glykosylering D1/D2 arm moduler å core acceptor. jeg, 4, AgOTf, Cp2HfCl2, toluen, 4 Å MS, 0 oC RT, 70%. ii, p- TSA, acetonitrile, RT, 57%. III, 5, AgOTf, Cp2HfCl2, toluen, 4 Å MS, 0 oC RT, 34%. iv(1) LiOH, 1,4-dioxane: H2O; 90 oC, 12 h; (2) Ac2O, pyridine, 12 h; (3) NaOMe, MeOH, 12 h; (4) Pd(OH)2, MeOH: H2O: HCOOH (5:3:2), H2, 36%. AgOTf: Sølv trifluromethanesulfonate; CP2HfCl2: Bis (cyclopentadienyl) hafnium dichloride, MS: molekylære sikter, produkt nomenklatur: 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2- acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosid. 8, 5-Azidopentyl - O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside. 9, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-{2,3,4,6- O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-( 1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-Dglucopyranoside 10, 5- Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)(α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)- Α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Glycan immobilisering på tabelldata ACG. (A) kjemisk endring av glycan med amino hale i en phosphonic syre hale kovalente feste på ACG lysbildet gjennom phosphonate kjemi. (B) distribusjon av glykaner på en ACG overflate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Glyan array analysen. (A) strukturer av syntetiske N- glykaner som skrives ut på en ACG-matrise. (B) bindende analyse av PG9 personlige glykaner jeg-XI på ACG matrise (venstre panel) og glycan blandinger av mann5 blandet med glykaner jeg-XI (høyre panel) med 100 µM konsentrasjon. De molar konsentrasjonene i µM for PG9 er gitt i forklaringen. Mener signal intensitet og standardfeil beregnet for fem uavhengige gjentak på tabellen vises. Insets viser fluorescens bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En klasse av HIV-1 bNAbs inkludert PG9, PG16 og PGTs 128, 141-145 ble rapportert å være svært potent i å nøytralisere 70-80% av sirkulerende HIV-1 isolater. Epitopes av disse bNAbs er svært bevart blant variantene av alle HIV-1 M, derfor de kan guide effektiv immunogen design for en HIV vaksine å lokke fram nøytraliserende antistoffer23,24,25 . Som en del av å identifisere glycan epitopes av HIV-1 bredt nøytralisere antistoffer, rapporterte vi den kjemisk og enzymatiske syntesen av et panel av høy mannose, hybrid og kompleks type oligosaccharides å danne en glycan matrise21, 22. De brukte glycan matrisene på N- hydroxysuccinimide-belagt (NHS) glass lysbilder er imidlertid finner lav affinitet karbohydrat-protein interaksjoner, sannsynligvis på grunn av heterogene glycan distribusjon fra hydrolyse av reaktiv N- hydroxysuccimide funksjonelle grupper på overflaten. For å overvinne begrensninger av konvensjonelle matrise formater, har vi utviklet en glycan utvalg på aluminiumoksid belegg-glass (ACG) lysbilder. Vi videre utført en homogenitet sammenligning mellom ACG matrisen og brukte NHS matrise å bevise at ACG matrisen tilbudt en mer homogen glycan presentasjon på dens overflate22. Vår innledende bindende analyse klarte ikke å observere binding av PG9 til noen av glykaner på NHS matrise (data ikke vist). Derfor for å definere bindende spesifisiteten av PG9, var glykaner jeg-XI knyttet til en phosphonic syre hale og trykt på ACG lysbildet med 100 µM av individuelle glykaner (Figur 4). Glycan immobilisering på ACG lysbilder gjennom phosphonate kjemi tilbudt en mer stabil og homogen distribusjon. Hver av glykaner ble trykt med fem gjentak og lysbilder var oppnådd fra en fluorescens skanning etter DyLight649-konjugerte esel anti-IgG antistoff inkubasjon. Bindende analysen av PG9 mot individuelle glykaner på ACG matrise (figur 5, venstre panel) antyder at PG9 interaksjon sterkt med hybrid-type glycan (X). Samspillet ble også oppdaget for høy mannose typen Man5 (glycan IV) og kompleks-type glycan (XI).

Molekylær nivå samspillet mellom PG9 og hybrid-type glycan (X) er vanskelig å avgjøre på grunn av manglende co krystall struktur informasjonen. Hybrid-type glycan X består av en kompleks type arm på 3-O plasseringen av kjernen og en trimannose arm forbundet til den 6-O plasser for den sentrale trisaccharide. Binding av PG9 til hybrid glycan X antyder at PG9 krever både mannose og sialic acid rester i nærheten for høy affinitet interaksjoner. For å identifisere glycan kombinasjonen som passer i PG9 binding lommen, utført vi en blandet glycan matrise studie. Glycan IV ble blandet med hver glycan fra jeg-XI i 1:1 muldvarp forholdet og oppdaget på tabelldata ACG. Bindende analyse av PG9 til hver av blandinger indikert at en kombinasjon av mann5 og en SCT (IV + XI) resulterte i den høyeste tilhørighet til PG9 sammenlignet med IV eller XI alene. I tillegg oppdaget blandinger som inneholder mann5 og disse inneholder sialylated antenner som glykaner VIII og X var også22. For første gang tilbys disse resultatene en rekke basert bevis for hetero-glykaner bindende oppførsel av PG9 som ble foreslått av krystall struktur studier av PG9 med HIV-1 gp120 V1/V2 domene23.

I konklusjonen, vi har vist en effektiv modulære chemo-enzymatisk strategi for utarbeidelse av svært variert N-koblet oligosaccharides på menneskelig glykoproteiner. I tillegg gir utviklingen av tabelldata ACG et effektivt middel til å bestemme ekstremt svak protein karbohydrater interaksjoner og, enda viktigere, interaksjoner som oppstår gjennom hetero-glykaner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takke tynn Film Technology Division, Instrument Technology Research Center (ITRC) og National anvendt forskningslaboratorier, Hsinchu Science Park, Taiwan. Dette arbeidet ble støttet av National Science Council (gi nei. De fleste 105-0210-01-13-01) og Academia Sinica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes? J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
  33. GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ (2017).

Tags

Kjemi problemet 132 chemo-enzymatisk syntese ACG glycan matriser HIV nøytralisere antistoffer N- glykaner spesifisitet profilering modulære tilnærming
Chemo-enzymatisk syntese av <em>N</em>- glykaner for matrisen utvikling og HIV antistoff profilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shivatare, S. S., Shivatare, V. S.,… More

Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C. Y., Wong, C. H. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter