Robust DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion för herbarieexemplar
Summary
Denna artikel visar ett detaljerat protokoll för DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion från herbarium material inklusive räddning av exceptionellt dålig kvalitet DNA.
Abstract
Herbaria är en ovärderlig källa av växtmaterial som kan användas i en mängd olika biologiska studier. Användning av herbarieexemplar associeras med ett antal utmaningar inklusive prov bevarande kvalitet, försämrat DNA och destruktiva provtagning av sällsynta exemplar. För att mer effektivt använda herbarium material i stora sekvensering projekt, behövs en tillförlitlig och skalbar metod av DNA isolering och bibliotek förberedelser. Detta papper visar ett robust, början till slut protokoll för DNA isolering och hög genomströmning bibliotek konstruktion från herbarieexemplar som inte kräver modifiering för enskilda prover. Detta protokoll är skräddarsydd för låg kvalitet torkade växten material och tar fördel av befintliga metoder genom att optimera vävnad slipning, ändra bibliotek storlek urval och att införa ett valfritt reamplification steg för låg avkastning bibliotek. Reamplification av låg avkastning DNA bibliotek kan rädda prover från oersättliga och potentiellt värdefulla herbarieexemplar förneka behovet av ytterligare destruktiva provtagning och utan att införa urskiljbar sekvensering bias för gemensamma Fylogenetiska tillämpningar. Protokollet har testats på hundratals gräsart, men förväntas vara anpassningsbar för användning i andra växt härstamningar efter kontroll. Detta protokoll kan begränsas genom extremt försämrat DNA, där fragment inte finns i intervallet önskad storlek, och sekundära metaboliter förekommer i vissa växtmaterial som hämmar rena DNA isolering. Övergripande, detta protokoll införs en snabb och omfattande metod som möjliggör för DNA isolering och bibliotek beredning av 24 prover i mindre än 13 h, med endast 8 h aktiv hands-on tid med minimala ändringar.
Introduction
Herbarium samlingar är en potentiellt värdefull källa till både arter och genomic mångfald för studier inklusive fylogenetik1,2,3, populationsgenetik4,5, bevarande biologi6, invasiva arter biologi7och drag evolution8. Möjligheten att få en rik mångfald av arter, populationer, geografiska platser och tidpunkter belyser ”skattkista”9 som är herbarium. Historiskt sett har försämrade beskaffenhet herbarium-derived DNA hindrat PCR-baserat projekt, ofta förvisa forskare att använda endast markörer i hög kopia, såsom regionerna kloroplast genomet eller interna transkriberas distanshylsan (ITS) av den ribosomal RNA. Kvaliteten på proven och DNA variera i stor utsträckning utifrån metoder för bevarande9,10, med dubbelsträngat raster och fragmentering från värmen används i torkningen är de vanligaste formerna av skador, skapar den så kallade 90% DNA lock-up som har pantsatta PCR-baserade studier11. Bortsett från fragmentering är den näst vanligaste frågan i herbarium genomik kontaminering, såsom som härrör från endophytic svampar13 eller svampar förvärvade efter döden efter samlingen men innan montering i herbarium12, dock problemet kan vara löst bioinformatically ges rätt svamp databasen (se nedan). En tredje, och mindre vanligt, problemet är sekvens ändring genom cytosin deaminering (C/G→T/A)14, även om det uppskattas vara låg (~ 0,03%) i herbarium exemplar11. Med tillkomsten av hög genomströmning sekvensering (HTS), kan frågan om fragmentering övervinnas med korta läsningar och sekvensering djup12,15, tillåter genomisk nivå datainsamling från talrika exemplar med låg kvalitet DNA, och ibland även tillåter hela genomet sekvensering15.
Herbarium prover blir oftare används och är en större del av fylogenetiska projekt16. En aktuell utmaning att använda herbarieexemplar för HTS konsekvent erhålla tillräcklig dubbel stranded DNA, en nödvändig förutsättning för sekvensering protokoll, från ett flertal arter i tid, utan att behöva optimera metoder för enskilda exemplaren. I detta papper demonstreras ett protokoll för DNA-extraktion och bibliotek beredning av herbarieexemplar som utnyttjar befintliga metoder och ändrar dem som möjliggör snabba och reproducerbara resultat. Denna metod möjliggör komplett bearbetning från prov till ett bibliotek med 24 prov i 13 h, 8 h hands-on tid, eller 16 h, 9 h hands-on tid, när det valfria reamplification steget krävs. Samtidig bearbetning av flera sampel är genomförbara, men den begränsande faktorn är centrifug kapacitet och tekniska skicklighet. Protokollet syftar till att kräva endast typisk laboratorieutrustning (termocykler, centrifug och magnetiska står) i stället för specialutrustning, såsom en nebulisator eller någon sonikator, för klippning DNA.
DNA kvalitet, fragment storlek och kvantitet är begränsande faktorer för användning av herbarieexemplar i hög genomströmning sekvensering experiment. Andra metoder för att isolera herbarium DNA och skapa hög genomströmning sekvensering bibliotek har visat nyttan av att använda så lite som 10 ng DNA16; men de kräver experimentellt bestämma optimala antalet PCR cykler krävs för bibliotek förberedelse. Detta blir opraktiskt när behandlar ytterst små mängder av livskraftiga dubbel strandsatta DNA (dsDNA), eftersom vissa herbarieexemplar producerar endast tillräckligt med DNA för ett enda bibliotek preparat. Metoden presenteras här använder ett enda antal cykler oavsett provet kvalitet, så ingen DNA är vilse i biblioteket optimering steg. I stället anropas ett reamplification steg när biblioteken inte uppfyller de minimibelopp som behövs för sekvenseringen. Många herbarium prover är sällsynta och besitter lite material vilket gör det svårt att motivera destruktiva provtagning i många fall. För att motverka detta presenterade protokollet tillåter dsDNA ingång storlekar mindre än 1,25 ng i förberedelseprocessen bibliotek, utvidgning av livskraftiga prover för hög genomströmning sekvensering och minimera behovet av destruktiva provtagning av exemplar.
Följande protokoll har optimerats för gräs och testats på hundratals olika arter från herbarium prover, även om vi förväntar oss att protokollet kan tillämpas på många andra växtgrupper. Det innehåller en valfri återhämtning steg som kan användas för att spara låg kvalitet och/eller sällsynta exemplar. Baserat på över tvåhundra herbarieexemplar testade, fungerar detta protokoll på prover med låga vävnad input och kvalitet, vilket möjliggör bevarandet av sällsynta exemplar genom minimal destruktiva provtagning. Här visas det att detta protokoll kan tillhandahålla högkvalitativa bibliotek som kan sekvenseras för phylogenomics-baserade projekt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som presenteras här är en omfattande och robust metod för DNA isolering och sekvensering bibliotek förberedelse från torkade växten exemplar. Konsekvensen av den metod och minimalt behov av att ändra det baserat på preparatet kvalitet gör det skalbara för stora herbarium-baserade sekvensering projekt. Införandet av ett valfritt reamplification steg för låg avkastning bibliotek tillåter införandet av låg kvalitet, låg kvantitet, sällsynt, eller historiskt viktiga prover som annars inte skul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Taylor AuBuchon-äldste, Jordan Teisher, och Kristina Zudock för hjälp med provtagning herbarieexemplar och Missouri botaniska trädgården för tillträde till herbarieexemplar för destruktiva provtagning. Detta arbete var stöd av ett stipendium från National Science Foundation (DEB-1457748).
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
References
- Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
- Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
- Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
- Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
- Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
- Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?. Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
- Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
- Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
- Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
- Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
- Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
- Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
- Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
- Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
- Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
- Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
- Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
- Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
- Herbarium Genomics. Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- . Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
- McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
- Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
- Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
- . Transposons Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
- Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).
