Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens
Summary
Dit artikel demonstreert een gedetailleerd protocol voor DNA isolatie en hoge gegevensdoorvoer sequencing bibliotheek bouw van herbarium materiaal met inbegrip van de redding van uitzonderlijk slechte kwaliteit DNA.
Abstract
Herbaria zijn een onschatbare bron van plantaardig materiaal dat kan worden gebruikt in een verscheidenheid van biologische studies. Het gebruik van herbarium specimens wordt geassocieerd met een aantal uitdagingen met inbegrip van monster behoud kwaliteit gedegradeerde DNA en destructieve bemonstering van zeldzame exemplaren. Om effectiever gebruiken herbarium materiaal grote sequencing projecten, een betrouwbare en schaalbare methode van DNA isolatie en bibliotheek voorbereiding nodig. Deze paper toont een robuuste, begin-to-end protocol voor DNA isolatie en hoge gegevensdoorvoer bibliotheek constructie van herbarium specimens die geen wijziging voor afzonderlijke monsters vereist. Dit protocol is op maat gemaakt voor lage kwaliteit gedroogde plant materiaal en neemt profiteren van bestaande methoden door het optimaliseren van weefsel slijpen, bibliotheek maat keuze wijzigen en invoering van een optionele reamplification stap voor lage opbrengst bibliotheken. Reamplification van lage opbrengst DNA bibliotheken kan redden monsters afgeleid van onvervangbare en potentieel waardevolle herbarium specimens, ontkenning van de noodzaak voor extra destructieve bemonstering en zonder merkbare sequencing bias voor common fylogenetische toepassingen. Het protocol is getest op honderden soorten gras, maar wordt verwacht om flexibel te zijn voor gebruik in andere geslachten van de plant na verificatie. Dit protocol kan worden beperkt door de uiterst aangetaste DNA, waar fragmenten niet bestaan in het bereik van de gewenste grootte, en secundaire metabolieten in sommige plantaardige materiaal aanwezig die een remmende werking schoon DNA isolatie. Globaal, is dit protocol introduceert een snelle en uitgebreide methode waarmee voor DNA isolatie en voorbereiding van de bibliotheek voor 24 samples in minder dan 13 h, met slechts 8 h van actieve hands-on tijd met minimale wijzigingen.
Introduction
Herbarium collecties zijn een potentieel waardevolle bron van zowel de soorten en de genomische diversiteit voor studies inclusief fylogenie1,2,3, populatie genetica4,5, instandhouding biologie6, invasieve soorten biologie7en trek evolutie8. De mogelijkheid om het verkrijgen van een rijke diversiteit aan soorten, populaties, geografische locaties en tijdstippen hoogtepunten de “schatkamer”9 thats het herbarium. Historisch, heeft de aangetaste aard van herbarium afkomstige DNA PCR-gebaseerde projecten, vaak indelings onderzoekers aan het gebruik van alleen markeringen gevonden in hoge exemplaar, zoals regio’s van de chloroplast genoom- of de interne getranscribeerde spacer (ITS) voor de ribosomal belemmerd RNA. Kwaliteit van specimens en DNA variëren uitgebreid op basis van methoden van behoud9,10, met double-stranded pauzes en versnippering van warmte in het droogproces wordt de meest voorkomende vormen van schade, het creëren van gebruikt de zogenaamde 90% DNA lock-up die PCR gebaseerde studies11heeft bezwaard. Afgezien van fragmentatie is het tweede meest voorkomende probleem in herbarium genomics besmetting, zoals die afkomstig is van endophytic schimmels13 of schimmels postmortale verworven na collectie maar vóór de montage in het herbarium12, hoewel Dit probleem kan worden opgelost bioinformatically gegeven de juiste schimmel database (zie hieronder). Een derde, en minder vaak, probleem is wijziging van de volgorde via cytosine (C/G→T/A) deamination14, hoewel het wordt geschat op lage (~ 0,03%) in herbarium specimens11. Met de komst van high-throughput sequencing (HTS), kan het probleem van de versnippering worden overwonnen met korte leest en sequencing diepte12,15, waardoor genomic-niveau data-acquisitie van talrijke exemplaren met lage kwaliteit DNA, en soms zelfs het hele genoom sequencing15toelaat.
Herbarium monsters worden steeds vaker gebruikt en zijn een grotere component fylogenetische projecten16. Een uitdaging van dit moment herbarium exemplaren te gebruiken voor HTS is consequent voldoende dubbele gestrande DNA, een noodzakelijke voorwaarde voor sequencing protocollen, verkrijgen van talrijke soorten in een tijdig, zonder te optimaliseren van methoden voor het individu exemplaren. In deze paper wordt een protocol voor DNA-extractie en bibliotheek voorbereiding van herbarium specimens die profiteert van bestaande methoden en hen te voorzien van snelle en repliceerbaar resultaten wijzigt aangetoond. Deze methode zorgt voor volledige verwerking vanaf specimen aan een bibliotheek voor 24 samples in 13 h, met 8 h hands-on tijd, of 16 h, met 9 h hands-on tijd, wanneer de optionele reamplification stap nodig is. Gelijktijdige verwerking van meer monsters is haalbaar, al is de beperkende factor centrifuge capaciteit en technische vaardigheid. Het protocol is ontworpen om alleen typische laboratoriumapparatuur (thermocycler centrifuge en magnetische stands) in plaats van gespecialiseerde apparatuur, zoals een vernevelaar of ultrasoonapparaat, voor het scheren van DNA vereisen.
DNA kwaliteit, fragment grootte en het aantal beperken factoren voor het gebruik van herbarium specimens in high-throughput sequencing experimenten. Andere methoden voor het isoleren van herbarium DNA en het maken van high-throughput sequencing bibliotheken hebben aangetoond dat het nut van het gebruik van zo weinig als 10 ng DNA16; maar ze vereisen het optimale aantal PCR experimenteel te bepalen cycli vereist voor de voorbereiding van de bibliotheek. Dit wordt onpraktisch als omgaan met buitengewoon kleine hoeveelheden van levensvatbare dubbele strandde DNA (dsDNA), zoals sommige herbarium exemplaren alleen voldoende DNA voor een preparaat één bibliotheek produceren. De methode die hier gepresenteerd maakt gebruik van een enkel getal van cycli ongeacht monster kwaliteit, dus geen DNA is verloren in bibliotheek optimization stappen. In plaats daarvan, is een stap in de reamplification wordt aangeroepen wanneer bibliotheken niet voldoen aan de minimale bedragen die nodig zijn voor het rangschikken. Vele herbarium monsters zijn zeldzaam en weinig materiaal, waardoor het moeilijk te rechtvaardigen destructieve bemonstering in veel gevallen bezitten. Om dit tegen te, kunt het gepresenteerde protocol dsDNA ingang maten van minder dan 1,25 ng in het voorbereidingsproces van de bibliotheek, uitbreiding van het toepassingsgebied van levensvatbare monsters voor high-throughput sequencing en het minimaliseren van de noodzaak voor destructieve bemonstering van specimens.
Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor grassen en getest op honderden verschillende soorten van herbarium monsters, hoewel we verwachten dat het protocol kan worden toegepast op vele andere plantengroepen. Het bevat een optionele herstelstap, die kan worden gebruikt voor het opslaan van lage kwaliteit en/of zeldzame exemplaren. Gebaseerd op meer dan tweehonderd herbarium exemplaren getest, werkt dit protocol op monsters met lage weefsel input en kwaliteit, waardoor het behoud van zeldzame specimens via minimale destructieve bemonstering. Hier is het aangetoond dat dit protocol kan bieden hoge kwaliteit Bibliotheken, die kunnen worden sequenced voor phylogenomics gebaseerde projecten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hier gepresenteerd is een uitgebreide en robuuste methode voor DNA isolatie en het rangschikken van bibliotheek bereiding op basis van gedroogde plant exemplaren. De consistentie van de methode en de minimale behoefte te wijzigen op basis van specimen kwaliteit maken het schaalbare voor groot herbarium gebaseerde sequencing projecten. De opname van een optionele reamplification stap voor lage opbrengst bibliotheken kan de opname van lage kwaliteit, geringe hoeveelheid, zeldzame, of historisch belangrijke voo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Taylor AuBuchon-Elder, Jordanië Teisher, en Kristina Zudock voor hulp bij bemonstering herbarium exemplaren en de Missouri Botanical Garden voor toegang tot herbarium exemplaren voor destructieve bemonstering. Dit werk was ondersteuning door een subsidie van de National Science Foundation (DEB-1457748).
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
References
- Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
- Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
- Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
- Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
- Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
- Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?. Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
- Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
- Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
- Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
- Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
- Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
- Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
- Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
- Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
- Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
- Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
- Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
- Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
- Herbarium Genomics. Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- . Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
- McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
- Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
- Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
- . Transposons Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
- Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).
