Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar
Summary
Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau aus Herbarium Material einschließlich Rettung von sehr schlechter Qualität DNA.
Abstract
Herbarien sind eine unschätzbare Quelle von pflanzlichem Material, das in einer Vielzahl von biologischen Studien verwendet werden kann. Die Verwendung von Herbar ist verbunden mit einer Reihe von Herausforderungen einschließlich Probenqualität Erhaltung geschädigter DNA und destruktive Probenahme seltene Exemplare. Um effektiver Herbarium Material in großen Sequenzierung Projekten verwenden, ist eine zuverlässige und skalierbare Methode der DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung erforderlich. Dieses Papier zeigt eine robuste, Anfang-Ende Protokoll für DNA-Isolierung und hohem Durchsatz Bibliotheksbau von Herbar, die keine Änderung für Einzelproben erfordert. Dieses Protokoll ist für niedrige Qualität getrocknet Pflanze Material und nutzt vorhandene Methoden durch die Optimierung der Gewebe Schleifen, ändern Bibliothek Größenauswahl und die Einführung eines optionalen Reamplification Schritt für geringe Ausbeute Bibliotheken zugeschnitten. Reamplification von geringer Ausbeute DNA-Bibliotheken kann Proben abgeleitet von unersetzlichen und potenziell wertvollen Herbar, negiert die Notwendigkeit für zusätzliche destruktive Probenahme und ohne erkennbare Sequenzierung Voreingenommenheit für gemeinsame retten. phylogenetische Anwendungen. Das Protokoll ist auf Hunderten von Grasart geprüft worden, aber wird voraussichtlich nach Prüfung für den Einsatz in anderen pflanzlichen Linien angepasst werden. Dieses Protokoll kann durch extrem geschädigter DNA, wo Fragmente nicht in der gewünschten Größenordnung vorhanden sind, und sekundäre Pflanzenstoffe in einigen Pflanzenmaterial vorhanden, die saubere DNA-Isolierung hemmen begrenzt. Dieses Protokoll stellt insgesamt eine schnelle und umfassende Methode, die DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung von 24 Proben in weniger als 13 Stunden mit nur 8 h aktive Handhabungszeit mit minimalen Anpassungen ermöglicht.
Introduction
Herbarium Sammlungen sind potentiell wertvolle Arten und genomische Diversität für Studien einschließlich Phylogenetik1,2,3, Populationsgenetik4,5, Erhaltung Biologie6, invasive Arten Biologie7und Merkmal Evolution8. Die Fähigkeit, eine große Vielfalt von Arten, Populationen, geografische Orte und Zeitpunkte zu erhalten unterstreicht die “Schatztruhe”9 , die das Herbarium. Historisch, hat degradierten Artder Herbarium abgeleitet DNA PCR-basierten Projekten, oft verwies Forscher mittels nur Marker gefunden in hohe Kopie, wie Regionen von Chloroplast Genom oder die interne transkribierten Distanzstück (ITS) aus der ribosomalen behindert. RNA. Qualität der Proben und DNA variieren ausgiebig basierend auf Methoden der Konservierung9,10, mit Doppelstrang-Brüche und Fragmentierung von Wärme in der Trocknung werden die häufigsten Formen von Schäden, die Schaffung der so genannte 90 % DNA Überbrückungskupplung, die PCR-basierten Studien11belastet hat. Abgesehen von Fragmentierung ist das zweithäufigste Problem im Herbarium Genomics Verunreinigungen, wie z. B. die endophytische Pilze13 abgeleitet oder Pilze Obduktion erworben nach Sammlung aber vor dem Einbau in das Herbarium12, obwohl dieses Problem kann gelöst Bioinformatically rechts Pilze Datenbank (s.u.) gegeben werden. Eine dritte, und weniger üblich, Problem ist Sequenz Modifikation durch Cytosin Deamination (C/G→T/A)14, obwohl es wird geschätzt (~ 0,03 %) niedrig sein Herbarium Exemplare11. Mit dem Aufkommen von Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS) kann das Problem der Fragmentierung mit kurzen Lese- und Sequenzierung Tiefe12,15, so dass Genomebene Datenerfassung aus zahlreichen Proben mit niedriger Qualität überwunden werden DNA, und manchmal sogar ganze Genom-Sequenzierung15erlaubt.
Herbarium Proben werden immer häufiger verwendet und sind ein größerer Bestandteil der phylogenetische Projekte16. Eine aktuelle Herausforderung für HTS Herbar zu verwenden ist konsequent ausreichend Doppel stranded DNA, eine notwendige Voraussetzung für die Sequenzierung Protokolle, von zahlreichen Tierarten in einer fristgerechten Weise erhalten ohne Methoden zur individuellen Optimierung Proben. In diesem Papier wird ein Protokoll für die DNA-Extraktion und Bibliothek Vorbereitung der Herbarbelege demonstriert, nutzt die vorhandenen Methoden und ändert sie, um schnelle und reproduzierbare Ergebnisse zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht für die Komplettbearbeitung von Probe zu einer Bibliothek von 24 Proben in 13 h, mit Hands-on-Zeit 8 h oder 16 h, mit 9 h Arbeitsaufwand beträgt, wenn der optionale Reamplification-Schritt benötigt wird. Gleichzeitige Verarbeitung von mehr Proben ist erreichbar, wenn der limitierende Faktor Zentrifuge Kapazität und technisches Geschick. Das Protokoll soll nur typische Laborgeräte (Thermocycler, Zentrifuge und magnetische steht) anstelle von Spezialausrüstung, wie z. B. einen Vernebler oder Sonikator, für Scheren DNA benötigen.
DNA-Qualität, Fragmentgröße und Menge sind Faktoren für den Einsatz von Herbar im Hochdurchsatz-Sequenzierung Experimente begrenzt. Weitere Methoden zum Herbarium DNA zu isolieren und Erstellen von Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheken haben gezeigt, das Dienstprogramm zu verwenden so wenig wie 10 ng DNA-16; jedoch bedürfen experimentell ermitteln die optimale Anzahl von PCR-Zyklen für Bibliothek Vorbereitung erforderlich. Dies wird unpraktisch, beim Umgang mit äußerst geringen Mengen an lebensfähigen Doppel DNA (DsDNA), gestrandet, da einige Herbar nur genügend DNA für eine einzelne Bibliothek Zubereitung produzieren. Die hier vorgestellte Methode verwendet eine einzelne Zahl der Zyklen unabhängig von Sample-Qualität, so dass keine DNA Bibliothek Optimierungsschritte verloren geht. Stattdessen wird ein Reamplification Schritt aufgerufen, wenn Bibliotheken nicht die Mindestbeträge für die Sequenzierung erforderlich erfüllen. Viele Herbarium Proben sind selten und besitzen wenig Material macht es schwierig, destruktive Probenahme in vielen Fällen zu rechtfertigen. Um dem entgegenzuwirken, die vorgestellte Protokoll ermöglicht DsDNA Eingang Größen von weniger als 1,25 ng in der Bibliothek Vorbereitungsprozess, Erweiterung des lebensfähigen Proben für Hochdurchsatz-Sequenzierung und die Notwendigkeit einer destruktiven Entnahme von Proben zu minimieren.
Das folgende Protokoll wurde optimiert für Gräser und getestet auf Hunderte verschiedener Arten von Herbarium Proben, obwohl wir erwarten, dass das Protokoll auf viele andere Pflanzengruppen angewendet werden kann. Freuen Sie sich auf eine optionale Wiederherstellungsschritt, die verwendet werden, um niedrige Qualität und/oder seltene Exemplare zu speichern. Basierend auf mehr als zweihundert Herbar getestet, funktioniert dieses Protokoll auf Proben mit niedrigen Gewebe ein- und Qualität, so dass für die Erhaltung der seltene Exemplare durch minimale destruktive Probenahme. Hier wird gezeigt, dass dieses Protokoll hochwertige Bibliotheken bieten kann, die für Datenqualität-basierte Projekte sequenziert werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellten Protokoll ist eine umfassende und solide Methode zur DNA-Isolierung und Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von getrockneten Pflanzen. Die Konsistenz des Verfahrens und des minimalen Notwendigkeit, es zu ändern basierend auf Probe Qualität machen es skalierbar für große Herbarium-basierte Sequenzierung Projekte. Die Einbeziehung eines optionalen Reamplification Schritts für geringe Ausbeute Bibliotheken ermöglicht die Aufnahme von geringer Qualität, geringe Menge, selten, oder historisch w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Taylor AuBuchon-Holunder, Jordan Teisher und Kristina Zudock um Hilfe bei der Probenahme Herbar und Missouri Botanical Garden Zugang zum Herbar für destruktive Probenahme. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Science Foundation (DEB-1457748).
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
References
- Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
- Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
- Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
- Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
- Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
- Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?. Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
- Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
- Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
- Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
- Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
- Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
- Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
- Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
- Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
- Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
- Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
- Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
- Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
- Herbarium Genomics. Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- . Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
- McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
- Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
- Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
- . Transposons Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
- Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).
