DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה
Summary
מאמר זה מדגים פרוטוקול מפורט DNA בידוד ובניה ספריית תפוקה גבוהה רצף מחומר עשבייה כולל חילוץ של ה-DNA בצורה יוצאת דופן באיכות ירודה.
Abstract
Herbaria הם מקור יקר ערך של חומר צמחי יכול לשמש במגוון מחקרים ביולוגיים. השימוש של דגימות עשבייה מזוהה עם מספר אתגרים כולל איכות שימור הדגימה, DNA מפורק דגימה ההרסני של דגימות נדירות. על מנת להשתמש ביעילות רבה יותר חומר עשבייה בפרוייקטים גדולים רצף, דרושה שיטה מהימן ומדרגי הכנה בידוד וספריית הדי. מאמר זה מדגים פרוטוקול חזקות, ההתחלה-to-end לבנייה DNA בידוד, תפוקה גבוהה ספריה של דגימות עשבייה שאינה דורשת שינוי לקבלת דוגמאות בודדות. פרוטוקול זה המותאם במיוחד עבור איכות נמוכה מיובשים צמח חומר לוקח יתרון השיטות הקיימות על-ידי מיטוב רקמות שחיקה, שינוי בחירת גודל הספרייה, היכרות עם שלב reamplification אופציונלי עבור ספריות תשואה נמוכה. Reamplification של ספריות DNA תשואה נמוכה יכול להציל את דגימות נגזר דגימות עשבייה ללא תחליף, ערך פוטנציאלי, שלילת הצורך לדיגום הרסניים נוספים וללא היכרות עם רצף ניכרת הטיה על השכל יישומים פילוגנטי. הפרוטוקול נבדק על מאות מינים דשא, אך צפוי להיות להתאמה לשימוש אחר שושלות הצמח לאחר אימות. פרוטוקול זה יכול להיות מוגבל על ידי ה-DNA ביותר, שבו קטעים שלא קיימים בטווח הרצוי, ועל ידי מטבוליטים משניים נוכח חומר צמח המעכבות נקי בידוד ה-DNA. בסך הכל, פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ומהירה המאפשרת בידוד ה-DNA והכנת ספריית דגימות 24 ב פחות מ 13 h, עם רק 8 שעות של זמן על הידיים פעילה עם שינויים מינימליים.
Introduction
עשבייה אוספים הם מקור ערך פוטנציאלי של מינים ושל גיוון גנומית ללימודי כולל פילוגנטיקה1,2,3, גנטיקה של אוכלוסיות4,5, שימור ביולוגיה6, מין פולש ביולוגיה7ותכונה האבולוציה8. היכולת לקבל מגוון רחב של מינים, אוכלוסיות, מיקומים גיאוגרפיים ונקודות זמן מדגיש את “אוצר”9 זה עשבייה. מבחינה היסטורית, מהות נגזר עשבייה DNA מפורק יש הפריע פרויקטים מבוססי ה-PCR, לעיתים קרובות להשכיב חוקרים באמצעות סמנים בלבד נמצאו ב העתק גבוהה, כגון אזורים של הגנום כלורופלסט או מרווח משועתקים פנימי (ITS) של ribosomal ה-RNA. האיכות של דגימות DNA להשתנות בהרחבה על השיטות לשימור9,10, עם הפסקות גדילי כפול, פיצול מהאש המשמשים בתהליך ייבוש הצורות הנפוצות ביותר של נזק, יצירת בסיס מה שנקרא 90% DNA שכלוא יש לתאר מחקרים מבוססי ה-PCR11. מלבד הפיצול, לסוגיה השנייה הכי נפוצה עשבייה גנומיקה היא זיהום, כגון זה נגזר פטריות endophytic13 או פטריות רכשה לאחר המוות לאחר אוסף אך לפני הרכבה עשבייה12, למרות זאת בעיה זו יכולה להיות bioinformatically פתור נתן את מסד הנתונים נכון פטרייתיים (ראו להלן). בעיה השלישי, פחות נפוץ, הוא שינוי רצף עד ציטוזין (C/G→T/א) דיאמינציה14, למרות מוערך יהיה נמוך (~ 0.03%) עשבייה דגימות11. עם כניסתו של תפוקה גבוהה רצף (HTS), סוגיית הפיצול ניתן להתגבר עם רצף עומק12,15, המאפשר רכישת נתונים ברמת גנומית של דגימות רבות עם איכות נמוכה של קריאות קצר ה-DNA, ואפילו לפעמים המתיר רצף הגנום כולו15.
עשבייה דגימות נעשה שימוש בתדירות גבוהה יותר, הם מרכיב גדול של פרויקטים פילוגנטי16. אתגר הנוכחי של משתמש עשבייה דגימות HTS היא בעקביות קבלת מספיק DNA נטושים כפול, תנאי הכרחי עבור רצפי פרוטוקולים, ממינים רבים מבעוד, ללא צורך לייעל שיטות עבור הפרט דגימות. בנייר זה, הוכח עבור הפקת דנ א והכנת ספריית דגימות עשבייה פרוטוקול זה מנצל שיטות קיימות ומשנה אותם כדי לאפשר תוצאות מהר ו לטבלה הניתנת לשכפול. שיטה זו מאפשרת להשלים עיבוד הדגימה לספריה של דגימות 24 h 13, עם הזמן על הידיים של 8 שעות, או ח 16, עם הזמן על הידיים 9 h, כאשר השלב reamplification אופציונלית נדרשת. עיבוד סימולטני של דגימות נוספות הוא בר השגה, אבל הגורם המגביל הוא יכולת צנטריפוגה, מיומנות טכנית. הפרוטוקול נועד דרוש רק טיפוסי ציוד מעבדה (thermocycler צנטריפוגה, דוכני מגנטי) במקום ציוד מיוחד, כגון מפוחים או sonicator, עבור הטיית ה-DNA.
איכות ה-DNA, פרגמנט גודל וכמות המגבילים את הגורמים לשימוש של עשבייה דגימות בניסויים רצף תפוקה גבוהה. שיטות נוספות לבודד דנ א עשבייה ויצירת רצף תפוקה גבוהה ספריות הראו את התועלת של שימוש רק 10 ng של הדנ א16; אולם הם דורשים השפעול קביעת המספר האופטימלי של PCR מחזורי הנדרש להכנה הספרייה. זה הופך מעשית כאשר להתמודד עם כמויות קטנות מאוד של קיימא כפול תקועים דנ א (dsDNA), כמו הדגימות עשבייה לייצר רק מספיק דנ א הכנה בספריה מסוימת. השיטה המוצגת כאן משתמש מספר בודד של מחזורים ללא קשר לאיכות הדגימה, כך אין דנ א הוא איבד ספריית אופטימיזציה שלבים. במקום זאת, צעד reamplification מופעל כאשר ספריות אינן עונות על הכמויות המינימליות לצורך עריכה ברצף. דוגמאות עשבייה רבים נדירים ושולט קצת חומר מקשה להצדיק את הדגימה הרסני במקרים רבים. כדי לשנות זאת, פרוטוקול הציג מאפשר dsDNA קלט מידות פחות מ 1.25 ng לתוך תהליך הכנה ספריה, הרחבת הטווח של דגימות קיימא עבור תפוקה גבוהה רצף וצמצום הצורך דגימה ההרסני של דגימות.
להלן כללי התנהגות יש כבר אופטימיזציה עבור עשבי, נוסה על מאות מינים שונים מדגימות עשבייה, אף אנו צופים כי ניתן להחיל את הפרוטוקול להרבה קבוצות אחרות של הצמח. הוא כולל שלב אופציונלי שחזור יכול לשמש כדי לחסוך באיכות נמוכה ו/או דגימות נדירות. בהתבסס על דגימות עשבייה מעל מאתיים נבדק, פרוטוקול זה פועל על דגימות עם קלט רקמות נמוכה ואיכות, המאפשר השימור של דגימות נדירות באמצעות דגימה הרסני מינימלי. הנה היא מופיעה בפרוטוקול זה יכול לספק ספריות באיכות גבוהה יכול להיות רציף לפרויקטים מבוססי phylogenomics.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול המובאת כאן היא שיטה מקיפה וחזק עבור ספריית הכנה של צמחים מיובשים דגימות DNA בידוד וסדר. העקביות של השיטה, מינימלי צורך לשנות אותו מבוסס על יצירת איכות הדגימה זה מדרגי לפרויקטים גדולים מבוססי עשבייה רצף. ההכללה של שלב reamplification אופציונלי עבור ספריות תשואה נמוכה מאפשר הכללת באיכות נמ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים טיילור AuBuchon-אלדר, ירדן Teisher, קריסטינה Zudock לעזרה בארגון דגימה עשבייה דגימות, ואת הגן הבוטני מיזורי לגישה עשבייה דגימות לדיגום הרסני. עבודה זו הייתה תמיכה על ידי מענק של הקרן הלאומית למדע (דב-1457748).
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
References
- Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
- Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
- Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
- Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
- Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
- Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?. Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
- Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
- Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
- Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
- Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
- Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
- Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
- Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
- Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
- Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
- Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
- Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
- Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
- Herbarium Genomics. Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- . Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
- McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
- Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
- Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
- . Transposons Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
- Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).
