Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario
Summary
Este artículo muestra un protocolo detallado para el aislamiento de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de material de herbario incluyendo rescate del ADN de muy mala calidad.
Abstract
Herbarios son una fuente valiosa de material vegetal que se puede utilizar en una variedad de estudios biológicos. El uso de especímenes de herbario está asociado con un número de desafíos, incluyendo calidad de preservación de la muestra ADN degradado y muestreo destructivo de especímenes raros. Para utilizar más eficazmente material de herbario en proyectos grandes de la secuencia, es necesario un método confiable y escalable de ADN aislamiento y biblioteca de preparación. Este documento muestra un protocolo robusto, de principio a fin para ADN aislamiento y alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario que requieren modificación para muestras individuales. Este protocolo se adapta para baja calidad secado planta material y toma ventaja de los métodos existentes mediante la optimización de tejido pulido, modificar la selección de tamaño de la biblioteca y presentando un paso de Reamplificación opcionales para las bibliotecas de bajo rendimiento. Reamplificación de bibliotecas de ADN de bajo rendimiento puede rescatar muestras derivadas de especímenes de herbario insustituible y potencialmente valiosa, negando la necesidad de muestreo destructivo adicional y sin introducir sesgo de secuencia perceptible común aplicaciones filogenéticas. El protocolo ha sido probado en cientos de especies de gramíneas, pero se espera que sea adaptable para el uso en otros linajes de la planta después de la verificación. Este protocolo puede ser limitada por ADN muy degradado, donde fragmentos no existen en la gama del tamaño deseado, y por metabolitos secundarios presentes en un material de planta que inhiben el aislamiento de ADN limpio. En general, este protocolo presenta un método rápido y completo que permite la extracción de ADN y preparación de la biblioteca de 24 muestras en menos de 13 horas, con solo 8 h de tiempo práctica activa con modificaciones mínimas.
Introduction
Colecciones de herbario son una fuente potencialmente valiosa de especies y diversidad genómica de estudios incluyendo phylogenetics1,2,3, genética de poblaciones4,5, conservación Biología6, de la biología de las especies invasoras7y rasgo evolución8. La capacidad para obtener una rica diversidad de especies, poblaciones, regiones geográficas y momentos destaca el “tesoro”9 que es el herbario. Históricamente, la naturaleza degradada del ADN derivado de herbario ha obstaculizado los proyectos basados en PCR, a menudo relegando los investigadores a usar sólo los marcadores encontrados en copia alta, como las regiones del genoma de cloroplasto o el espaciador transcrito interno (ITS) de la ribosomal ARN. Calidad de las muestras y ADN varían ampliamente en base a métodos de conservación9,10, con las roturas de doble hebra y fragmentación de calor utilizado en el proceso de secado siendo las formas más comunes de daños, la creación de la supuesto 90% ADN calabozo que ha gravado estudios basados en PCR11. Aparte de fragmentación, lo segundo más frecuente en la genómica de herbario es contaminación, tales como que derivado de los hongos endófitos13 u hongos adquirieron post mortem después de la recolección, pero antes de montar en el herbario12, aunque este problema puede ser solucionado bioinformatically dado la derecha fungicida base de datos (véase abajo). Un problema terceros y menos común, es modificación de la secuencia a través de citosina desaminación (G→T/C/A)14, aunque se estima que bajo (~ 0,03%) en ejemplares de herbario11. Con el advenimiento de secuenciación de alto rendimiento (HTS), la cuestión de la fragmentación puede superarse con lecturas cortas y secuenciación profundidad12,15, permitiendo la adquisición de datos de nivel genómico de numerosas muestras con baja calidad ADN e incluso a veces permitiendo que todo el genoma secuencia15.
Muestras de herbario son cada vez más frecuente y son un componente más grande de proyectos filogenética16. Un reto actual de la utilización de especímenes de herbario para HTS constantemente es obtener suficiente ADN de trenzado doble, un requisito previo necesario para los protocolos de la secuencia, de numerosas especies de manera oportuna, sin necesidad de optimizar los métodos para el individuo muestras. En este documento, un protocolo para la extracción de ADN y biblioteca preparación de especímenes de herbario se demuestra que se aprovecha de los métodos existentes y modifica para permitir resultados rápidos y reproducibles. Este método permite el completo procesamiento del espécimen a una biblioteca de 24 muestras 13 h, con el tiempo práctico 8 h o 16 h, con tiempo práctica 9 h, cuando se requiere el paso de Reamplificación opcional. Proceso simultáneo de muestras más es factible, aunque el factor limitante es la centrifugadora de la capacidad y habilidad técnica. El protocolo está diseñado para requerir sólo típico equipo de laboratorio (termociclador, centrífuga y soportes magnéticos) en lugar de equipo especializado, como un nebulizador o un sonicador, para el corte de ADN.
Calidad de ADN, el tamaño de fragmento y cantidad son limitantes para el uso de ejemplares de herbario en experimentos de secuenciación de alto rendimiento. Otros métodos para aislar ADN de herbario y crear bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento han demostrado la utilidad de utilizar tan poco como 10 ng de ADN16; sin embargo necesitan determinar experimentalmente el número óptimo de PCR ciclos necesarios para la preparación de la biblioteca. Esto se hace impracticable cuando tratar con muy pequeñas cantidades de viable doble trenzado DNA (dsDNA), como algunos ejemplares de herbario producen sólo suficiente ADN para la preparación de una sola biblioteca. El método presentado aquí utiliza un número de ciclos independientemente de la calidad de la muestra, por lo que no hay ADN se pierde en los pasos de optimización biblioteca. En cambio, un paso de Reamplificación se invoca cuando las bibliotecas no cumplen con los montos mínimos necesarios para la secuencia. Muchas muestras de herbario son raras y poseen poco material, lo que hace difícil justificar muestreo destructivo en muchos casos. Para contrarrestar esto, el protocolo presentado permite dsDNA entrada tamaños menos de 1.25 ng en el proceso de preparación de la biblioteca, ampliando el alcance de las muestras viables de alto rendimiento de secuenciación y minimizando la necesidad de muestreo destructivo de muestras.
El siguiente protocolo ha sido optimizado para las hierbas y probado en cientos de diferentes especies de muestras de herbario, aunque esperamos que el protocolo se puede aplicar a muchos otros grupos de plantas. Incluye un paso de recuperación opcional que puede utilizarse para salvar a baja calidad o especímenes raros. Basado en más de 200 especímenes de herbario probados, este protocolo trabaja en especímenes con entrada baja de tejido y calidad, lo que permite la preservación de especímenes raros a través de un mínimo muestreo destructivo. Aquí se demuestra que este protocolo puede proporcionar bibliotecas de alta calidad que pueden ser secuenciadas para proyectos basados en la filogenómica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí es un método integral y robusto para aislamiento de DNA y la secuencia de preparación de biblioteca de muestras de la planta seca. La consistencia del método y mínima necesidad de alterarlo según el ejemplar calidad hacen que escalable para proyectos grandes secuenciación basada en herbario. La inclusión de un paso de Reamplificación opcionales para las bibliotecas de bajo rendimiento permite la inclusión de baja calidad, baja cantidad, rara o históricamente importantes muestras qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Taylor AuBuchon-anciano, Jordania Teisher y Kristina Zudock asistencia en ejemplares de herbario de muestreo y el jardín botánico de Missouri para el acceso a los especímenes de herbario para muestreo destructivo. Este trabajo fue el apoyo de una beca de la National Science Foundation (DEB-1457748).
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
References
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