Summary
الغربية قياسية النشاف البروتوكول الأمثل لتحليل عدد قليل من 500 الجذعية المكونة للدم أو الخلايا السلف. التحسين يشمل حذراً في التعامل مع العينة الخلية والحد من عمليات نقل بين أنابيب مباشرة ليسينج الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنموذج لايمملي.
Abstract
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) خلايا نادرة، مع الماوس نخاع العظام التي تحتوي على فقط 25,000 ~ المظهرية طويلة الأجل إعادة إسكانها يكونوا هسكس. وكان بروتوكول blotting غربية الأمثل ومناسبة لتحليل إعداد صغيرة من هسكس (500-15,000 الخلايا). هسكس المظهرية تنقيته، وحسابها بدقة، وتفكيك مباشرة في لايملي عينة المخزن المؤقت. ليساتيس التي تحتوي على إعداد متساوية من خلايا تم تحليلها بواسطة الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، ووصمة عار وأعد وتجهيزها بعد الغربية القياسية النشاف البروتوكولات. باستخدام هذا البروتوكول، 2,000-5,000 هسكس يمكن تحليلها بصورة روتينية، وفي بعض الحالات يمكن الحصول على بيانات من عدد قليل من الخلايا 500، مقارنة بخلايا 20,000 إلى 40,000 عنها في معظم المنشورات. هذا البروتوكول ينبغي أن ينطبق عموما على الخلايا الأخرى المكونة للدم، ويتيح التحليل الروتيني لإعداد صغيرة من الخلايا باستخدام الإجراءات المختبرية القياسية.
Introduction
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي الذاتي تجديد الخلايا التي يمكن أن تؤدي إلى جميع الدم الأنساب. فهي نادرة نسبيا من الخلايا في نخاع العظام، يجعل من الصعب التحليلات الكيميائية الحيوية. النهج المناسبة لتحليل خلايا نادرة، مثل التدفق الخلوي، كانت مفيدة للغاية لقياس الكميات النسبية من علامات سطح الخلية والبروتينات داخل الخلايا. ومع ذلك، يتطلب تحليل البروتينات داخل الخلايا باستخدام الخلية بيرميبيليزيشن إجراءات لتمكين الوصول إلى جسم، وليس كل الخلايا السطحية [ابيتوبس] البقاء على قيد الحياة هذه الإجراءات1،2. وباﻹضافة إلى ذلك، الأجسام المضادة التي تميز بين منتجات بروتين مختلف isoforms أو الانقسام ولا تتوفر غالباً للتدفق الخلوي، وذلك المحققين لا تزال تعتمد على البقع الغربية لبعض أنواع التحليل.
تحليل لطخة غربية للخلية ليساتيس إجراء روتيني في معظم المختبرات. يمكن تنقية الخلايا تحت ظروف الأم التي تحافظ على [ابيتوبس] جزيئات سطح الخلية، ويمكن بعد ذلك أعد ليساتيس الخلية وتحليلها. ومع ذلك، يمكن أن يتطلب تحليل البروتينات في الخلية الأولية نادرة السكان بالغربية لطخة يوثانيزينج إعداد كبيرة من الحيوانات للحصول على ما يكفي من خلايا. بإجراء تعديلات صغيرة على عدة خطوات، كان بروتوكول blotting غربية تقليدية قادرة على الكشف عن البروتينات في عدد قليل نسبيا من هسكس (500-15,000، اعتماداً على بروتين الفائدة). وتشمل التعديلات بدقة عد الخلايا، بدقة التعامل مع الخلية بيليه، الحد من عمليات نقل الخلايا بين أنابيب تقليل الخسائر في الخلية، وليسينج عدد محدد من الخلايا مع تحميل تتركز العازلة التي تحتوي على بروتوزوم و مثبطات الفوسفاتيز. وتشمل العديد من التقارير المنشورة البقع الغربية التي تم الحصول عليها مع 20,000 أو أكثر هسكس3،،من45،،من67؛ سوف يقلل هذا الإجراء البسيط عدد الخلايا والحيوانات التجريبية اللازمة لإنتاج بيانات مكافئة من بين 4 و 40 ضعفا. البروتوكول يهدف إلى تطبيع النتائج على أساس كل خلية، بدلاً من رقابة داخلية. وهذا يتيح الكشف عن التخفيضات الإجمالية في مستويات البروتين التي يمكن التغاضي عنها إذا هي تطبيع البيانات إلى رقابة داخلية. ووصفت أهمية تطبيع على أساس كل خلية لتحليل البيانات التعبير الجيني8، وينطبق نفس المبدأ على تحديد كمية البروتينات بوصمة عار الغربية. هذا البروتوكول الأمثل ينبغي أن يكون مفيداً لأي شخص بحاجة إلى تحليل عدد صغير من الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب أن تتم جميع الإجراءات وفقا لاستخدام الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للرعاية. الإجراءات التي وضعت من أجل تحليل مورين الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (هسكس و HPs)، ولكن يمكن تكييفها لتحليل السكان خلية أخرى.
1-التدفق الخلوي عزلة هسكس مورين و HPs
- حصاد خلايا نخاع العظام مورين كما هو موضح في الأدب6.
ملاحظة: في البيانات المعروضة في الشكل 1 و الشكل 2، وكان حصاد نخاع العظام من الفئران C57BL/6J. - أداء نسب استنفاد الخلايا نخاع العظام باستخدام مجموعة أدوات استنفاد نسب ماوس، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة ضد علامات الخلية السطحية للفائدة ك وصف7. في هذه التجارب هو مبين في الشكل 1 و الشكل 2، تستخدم الأجسام المضادة للهيئة-1 كيت، Flt3 وعلامات النسب (لين) Mac1، Gr1، CD3e، B220، و Ter119.
- فرز 2,000 20,000 لين– Sca1++ Flt3 عدة خلايا– (HSCs) أو لين–Sca1–الخلايا كيت+ (هبس) في أنابيب ايبندورف 1.5 مل يحتوي على 0.1 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع الأبقار الجنين 2% مصل الدم (FBS).
ملاحظة: للبيانات المبينة في الشكل 1 و الشكل 2، تم فرز الخلايا استخدام Cytometer التدفق مع فوهة 70 ميكرومتر. حجم جمع الحد الأقصى 1.4 مل.
2. إعداد نموذج
ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة. عملية العينة بعناية فائقة. عند إزالة المادة طافية، يكون حريصا جداً على عدم تعكير بيليه الخلية.
- أجهزة الطرد المركزي 1.5 مل الأنابيب التي تحتوي على خلايا تم فرزها في دوار دلو يتأرجح عند 4 درجة مئوية، 500 غرام x، لأدنى 5 إزالة كافة ولكن ما يقرب من 100 ميليلتر من المادة طافية من الخلية بيليه جداً برفق باستخدام ماصة وتلميح بيبيت ميليلتر 20. عدم الإزعاج بيليه.
- إذا كانت العينة تحتوي على خلايا أقل من 5,000، وأقل من 0.2 مل من الحجم الإجمالي للعينة تم فرزها، نقل الخلايا أولاً إلى ربط انخفاض 0.2 مل أنابيب PCR قبل الطرد المركزي.
- إذا كان النموذج يحتوي على خلايا أقل من 5,000 وحجم أكثر من 0.2 مل، تدور الخلايا إلى الأسفل مع أجهزة الطرد مركزي في 4 درجات مئوية، 500 x ز، لمدة 5 دقائق، وإزالة كافة ولكن 200 ميليلتر من المادة طافية. تعليق إعادة الخلايا الأعلاف في ميليلتر 200 المتبقية من المادة طافية، ثم نقل الخلايا إلى أنابيب PCR 0.2 مل وتدور إلى أسفل مرة أخرى. إزالة كافة ولكن 20-30 ميليلتر من بيليه بعد الدوران الثاني وتعليق إعادة الخلايا.
- ريسوسبيند الخلايا الموجودة في اليسار طافية في الأنبوب. إذا لزم الأمر، إضافة برنامج تلفزيوني إضافي بنسبة 2% FBS/برنامج تلفزيوني (يمكنك أيضا استخدام 2% ألبومين المصل البقري (BSA)/برنامج تلفزيوني، أو برنامج تلفزيوني وحدها) للحصول على تركيز 5 x104 إلى 5 × 105 خلايا/مل.
ملاحظة: استخدام حساب الخلية التي تجمعها الخلوي لتقدير حجم تستخدم لتعليق الخلايا. - استخدام ميليلتر 2-5 تعليق إعادة الخلايا لتحديد تركيز خلية دقيقة استخدام عداد الآلي خلية (اتباع إرشادات الشركة المصنعة) أو هيموسيتوميتير9.
- نقل كمية من تعليق إعادة الخلايا التي تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا إلى 1.5 مل أنابيب جديدة. للتجربة في الشكل 1، نقلوا هسكس أو هبس 2,000، 1000 أو 500. العدد المطلوب من الخلايا تعتمد على قوة الإشارة التي حصل عليها لطخة غربية، ويتحدد تجريبيا. إجراء النقل باستخدام ميليلتر 20 أو 100 ميليلتر ايبندورف ماصة تلميح.
- الطرد المركزي الخلايا في دوار دلو يتأرجح في 4 درجات مئوية، 500 x ز، لمدة 5 دقائق.
- لإنشاء 100 × حلول الأسهم، حل مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز في [دمس] وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- تحضير x Laemmli 2 عينة المخزن المؤقت بتمييع العازلة عينة x Laemmli 4 المقدمة من الشركة المصنعة مع مبلغ مساو من الماء المقطر. إضافة مبلغ مناسب للمخزون 100 x من مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز للحصول على تركيز نهائي لمثبطات x 2 في المخزن المؤقت لنموذج x Laemmli 2.
ملاحظة: يمكن إجراء المخزن المؤقت نموذج x Laemmli 2 مسبقاً، ولكن ينبغي إضافة مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز فورا قبل إضافة 2 x Laemmli عينة المخزن المؤقت (بالإضافة إلى مثبطات) لبيليه الخلية الخلايا، وكما هو موضح في الخطوة التالية. - إزالة جزء من المادة طافية من بيليه الخلية، وإلى المادة طافية المتبقية في الأنبوب مع بيليه الخلية بعناية، وإضافة وحدة تخزين تساوي 2 x Laemmli عينة المخزن المؤقت بالإضافة إلى مثبطات بروتوزوم والفوسفاتيز لتحقيق تركيز نهائي 500 خلايا/ميليلتر في x Laemmli 1 عينة المخزن المؤقت.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا قمت بنقل الخلايا 2,000 في إجمالي حجم 20 ميليلتر لأنبوب في "الخطوة 2، 5"، بعد سينتريفوجينج الخلايا (الخطوة 2.6) يجب عليك إزالة ميليلتر 18 من المادة طافية من بيليه، وميليلتر 2 من المادة طافية المتبقية إضافة وحدة تخزين متساوية (2 ميليلتر) من 2 × لايملي عينة العازلة لتحقيق تركيز نهائي من الخلايا 500/ميليلتر في x Laemmli 1 عينة المخزن المؤقت. - ريسوسبيند بيليه لتوليد في أقرب وقت ممكن. عند هذه النقطة، يمكن أن تكون العينات اليكتروفوريسيد فورا من خلال المواد الهلامية صحيفة بيانات السلامة-الصفحة، أو يمكن انطباق المجمدة في سائل ن2 وتخزينها في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
3-التفريد
- الحرارة ليساتيس في كتلة حرارة عند 95 درجة مئوية أو في الماء المغلي لمدة 5 دقائق.
- اليكتروفوريسي 1-40 ميليلتر من ليساتيس (التي تحتوي على من 500 حتى 20,000 خلية مكافئات) من خلال الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية في 100 فولت باستخدام البروتوكولات القياسية10.
ملاحظة: وحدة التخزين المحملة في الهلام ليستي يتحدد بعدد الخلايا اللازمة لتوليد إشارة المرغوب فيه، وسوف يعتمد على وفرة البروتين من الفائدة، ونوعية الأجسام المضادة. تم الحصول على البيانات في الشكل 1 مع 2,000، 000 1 و 500 خلية مكافئات من ليساتي. عرض البئر ينبغي في المجموعة من 3 مم إلى 1.5 مم-1.5 ملم يمكن أن تكون الأسنان قص من مشط متاحة تجارياً مع أوسع الأسنان باستخدام مقص.
4-نقل وكتلة
ملاحظة: إجراء وصمة عار غربية عقب البروتوكولات القياسية11. ويرد موجز الخطوات هنا:
- بريتريت غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن مع الميثانول ل 10 s، ثم أغسل الغشاء بإيجاز مع الماء المقطر.
- نقل البروتين من جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة للغشاء اتباع الإرشادات الموجودة في دليل المستخدم توفيرها من قبل الشركة المصنعة للجهاز على نقل.
- بعد نقل، كتلة الغشاء مع 2 مل من 5% البقري ألبومين المصل (BSA) في ببست (برنامج تلفزيوني مع 0.1% توين) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية عقب البروتوكولات القياسية11.
5-جسم وسم
- احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة على شاكر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية استخدام تخفيف الجسم المضاد الذي أوصت به البائع.
ملاحظة: في "الجدول للمواد"، يتم إظهار الأجسام المضادة، الذي كنا قد صدق هسكس و HPs وتخفيف جسم المقابلة،. أداء جسم العلامات باستخدام إجراءات معيارية8.
6-كشف
- يغسل الغشاء 3 مرات، 5 دقائق لكل غسل في ببست في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الغشاء مع 2 مل من المخزن المؤقت تشيميلومينيسسينسي المعززة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كشف الإشارات استخدام نظام تصوير عقب تعليمات، الشركة المصنعة أو الفيلم autoradiography وتحميض أفلام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر نتائج تمثيلية من 500-000 2 المنقي هسكس و HPs في الشكل 1 و الشكل 2. ويمكن الكشف عن إشارة β-أكتين في الشكل 1 من عدد قليل من 500 هسكس وهبس تنقيته من نخاع العظام واحدة بالماوس. ملاحظة أن تحميل ليساتيس في الآبار 1.5 مم تنتج إشارة أقوى بكثير من 500 HPs من التحميل إلى الآبار 3.0 ملم. الرقم 2 هو وصمة عار غربية من EIF4G والفسفره Rps6 (ف-Rps6)، اللذين يشاركون في تنظيم بروتين الترجمة12، في هسكس، وفي هبس مع أو بدون التحفيز بالخلايا الجذعية عامل (SCF) في المختبر.
رقم 1: لطخة غربية ل β أكتين يؤديها مع ليساتيس من الفاري هسكس و HPs. تم فرز هسكس من خلايا نخاع العظام مورين النسب المنضب كلين–Sca1++ Flt3 عدة خلايا– ، و HPs كانت Sca1 لين––كيت+. كانت اليكتروفوريسيد ليساتيس أعد من أرقام مختلفة من الخلايا عن طريق جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 12% المعدة باستخدام ألواح زجاجية مصغرة مع الفواصل 1 مم. وكان سبر وصمة عار مع الأجسام المضادة إلى β أكتين. وصمة عار يظهر إشارات المقارنة β-أكتين من 500 إلى هبس 2,000 عندما تم تحميل في ليساتيس في آبار 1.5 مم (الممرات 4-6) مقارنة بالآبار 3 مم (الممرات 1-2). تم تحميل ليساتيس من 000 2 إلى 500 الخلايا على الممرات 7 إلى 9. M، علامات الوزن الجزيئي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحليل لطخة غربية هسكس طازجة معزولة، و HPs وحفز في المختبر مع سيتوكين الخلايا الجذعية عامل (SCF). هبس تم تنقيته من الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، وفصل، حراكه في 2% FBS/برنامج تلفزيوني، عد، ثم انقسم إلى اثنين من أنابيب. وقد حفزت هبس في الأنبوب الأول مع صندوق إنقاذ الطفولة (10 نانوغرام/مل) لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (+ صندوق إنقاذ الطفولة)، و HPs في الثانية كانت مثقف أنبوب لمدة 5 دقائق في الغياب من صندوق إنقاذ الطفولة (-SCF). ثم تم فصل الخلايا وتفكيك خلية بيليه مع لايملي عينة المخزن المؤقت. هسكس تنقيته وتفكيك مباشرة مع لايملي عينة المخزن المؤقت دون استزراع. تم تحميله في الآبار 1.5 مم ليساتيس واليكتروفوريسيد من خلال المواد الهلامية صحيفة بيانات السلامة-الصفحة 12%. وقد وضعت وصمة عار مع الأجسام المضادة لعامل استطالة المبادر ز 4 (EIF4G)، β-أكتين، ووحدة فرعية الريبوسوم الصغيرة فوسفوريلاتيد S6 (ف-Rps6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النشاف الغربية تقنية شائعة لكشف البروتينات المحددة وتفعيل مسارات الإشارات في الأنسجة أو الخلايا. عن طريق إدخال تعديلات بسيطة على إجراء استخداماً، كنا قادرين على اكتشاف البروتينات المختلفة 15 (جدول المواد) بشكل روتيني في هسكس 15,000، وفي بعض الحالات في عدد قليل من هسكس 500. The most الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول: 1) دقة عد الخلايا 2) التقليل إلى أدنى حد من عدد عمليات نقل بين أنابيب و 3) ليسينج الخلايا مباشرة مع لايملي عينة المخزن المؤقت. عندما ليسينج بيليه الخلية مع لايملي عينة المخزن المؤقت، وجدنا أنه بدلاً من إزالة كل من المادة طافية من بيليه الخلية وإعادة تعليق في "لايملي عينة المخزن المؤقت"، إذا نحن بدلاً من ترك كمية صغيرة من المادة طافية في الأنبوب وإضافة ما يعادل حجم 2 × لايملي عينة المخزن المؤقت، يمكن أن نتجنب فقدان الخلية. سينتريفوجينج الخلايا في دوار دلو يتأرجح انخفض أيضا خطر فقدان الخلية. تقليل عرض البئر تقليم أسنان المشط تحسنت حساسية الكشف.
مع هذه التعديلات البسيطة للإجراء، كنا قادرين على الحصول على النتائج استنساخه مساوية لتلك في الورقات المنشورة التي تستخدم أكثر من 10-20 مرات الخلايا3،4،،من56، 7-علاوة على ذلك، يمكن تجريد البقع لإعادة النشاف اتباع الإجراءات القياسية13، زيادة مقدار المعلومات التي يمكن الحصول عليها من عدد صغير من الخلايا. سيكون محدودا القدرة على اكتشاف البروتينات ذات الاهتمام بنوعية الأجسام المضادة ووفرة البروتين. هذا الأسلوب تم التعديل ينبغي أن يقلل كثيرا من عدد الحيوانات اللازمة للحصول على بيانات البروتين من الخلية نادرة السكان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تعارض في المصالح تعلن.
Acknowledgments
المعاهد الوطنية "للصحة" منح R01 CA149976 (N.A.S) تدعم هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
References
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
- Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
- Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
- Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
- Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
- Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
- Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
