Lipides Index détermination par Fluorescence liquide de récupération dans le champignon pathogène Ustilago Maydis

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour obtenir l’index de gouttelettes de lipides (index LD) pour étudier la dynamique des triacylglycérols dans les cellules cultivées dans des expériences de haut débit. L’essai d’index LD est une méthode simple et fiable qui utilise BODIPY 493/503. Ce test n’a pas besoin dispendious extraction de lipides ou d’analyse de la microscopie.

Abstract

L’article montre comment implémenter le test d’indice de LD, qui est un dosage sensible microplaque pour déterminer l’accumulation des triacylglycérols (TAGs) dans des gouttelettes lipidiques (LDs). Indice de LD est obtenu sans extraction de lipides. Il permet de mesurer le contenu de LDs dans des expériences de haut débit dans des conditions différentes, telles que croissance riche ou médias azote appauvri. Bien que la méthode a été décrite pour la première fois d’étudier le métabolisme de gouttelettes de lipides chez Saccharomyces cerevisiae, il a été appliqué avec succès pour le basidiomycète Ustilago maydis. Fait intéressant, et parce que le LDs sont des organites phylogénétiquement conservées dans les cellules eucaryotes, la méthode peut être appliquée à une grande variété de cellules, de la levure pour les cellules de mammifères. L’index LD repose sur le test de récupération de liquide de fluorescence (LFR) de la BODIPY 493/503 dans des conditions de refroidissement, par l’ajout de cellules fixé avec le formaldéhyde_. Iode de potassium est utilisé comme un extincteur de fluorescence. Le rapport entre la fluorescence et les pentes de la densité optique est appelé indice de LD. Pentes sont calculées à partir de droites obtenues lorsque BODIPY fluorescence et la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) sont tracées contre l’ajout de l’échantillon. Qualité des données optimale se traduite par des coefficients de corrélation égales ou supérieure à 0,9 (r ≥ 0,9). Plusieurs échantillons peuvent être lues en même temps qu’elle peut être implémentée dans une microplaque. BODIPY 493/503 étant un fluorescent lipophile teindre que les partitions dans les gouttelettes de lipides, il peut être utilisé dans de nombreux types de cellules qui s’accumulent de LDs.

Introduction

Gouttelettes lipidiques (LDs) sont omniprésents corps gras intracellulaires, composés d’un noyau de lipides neutres, principalement des TAGs et des esters de stérol (SE). Le noyau est entouré d’une monocouche de phospholipides qui interagit avec les protéines comme perilipin et enzymes impliquées dans la synthèse de lipides neutres, tels que le diacylglycérol acyl-transférase, l’acétyl-CoA carboxylase et l’acyl-CoA synthase¹. En raison de son comportement dynamique, la monocouche de phospholipides contient également des triacylglycérol lipase qui hydrolysent les TAGs et SE². Selon le type de cellule et de l’organisme, lipides neutres stockées peuvent être utilisés pour produire de l’énergie, ou synthétisent des phospholipides et des molécules de signalisation. Chez les levures et autres champignons, le contenu du LDs change en réponse aux variations du rapport carbone/azote dans les milieux de culture, ce qui indique qu’une diminution d’azote disponible pourrait être la clé pour augmenter les lipides neutres production^{3,4 ,},⁵. La production de quantités élevées de TAGs dans la levure a une utilisation potentielle en biotechnologie comme source de biocarburants et de l’industrie alimentaire. Certains lipides stockés contiennent des proportions élevées d’acides gras polyinsaturés, comme les oméga 3 et oméga 6, avec importance nutritionnelle et alimentaire ^{6,7,8,9,10 , 11}. si des cellules de mammifères, y compris les cellules humaines, contiennent également des TAGs et des esters de cholestérol. La monocouche de phospholipides interagit avec les mammifères homologues des protéines décrites dans la levure LDs et avec une protéine additionnelle, perilipin, qui est absente dans le S. cerevisiae¹². On a proposé le rôle de la monocouche de phospholipides et ses protéines associées est pour stabiliser la structure de LDs et autoriser l’interaction du LDs avec organites comme les mitochondries, le réticulum endoplasmique, peroxysomes et vacuoles, principalement pour l’échange de lipides ^13,,¹⁴. Fait intéressant, chez les humains, LDs semblent être impliqués dans des pathologies comme le diabète de type 2, l’athérosclérose, stéato-hépatite et maladie coronarienne, dans lequel il y a une augmentation de leur nombre ^15,16,17 . Certains types de virus utilisent LDs comme plates-formes pour assembler les virions ^2,18,19.

En raison des implications des LDs dans des pathologies humaines et leur utilisation biotechnologique, l’exacte détermination expérimentale de la formation de LDs est une tâche importante. Cet article décrit un test fiable basé sur la récupération de la fluorescence (LFR) de BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentaméthyl-4-bora-3 a, 4 a-diaza-s-indacene), pour obtenir une valeur relative de la teneur en lipides neutres dans les cellules. Avec ce test, il est possible de suivre la dynamique de l’accumulation de lipides neutres chez les champignons comme U. maydis et S. cerevisiae, ainsi que dans les cellules de mammifères, sans besoin d’ extraction de lipides ²⁰. La méthode a été appliquée pour la première fois chez S. cerevisiae pour identifier les protéines phosphatases et kinases impliquées dans la régulation du métabolisme des lipides. Cela n’était possible sans extraction de lipides ou de purification de protéine^21,22. LFR a également servi à créer la dynamique de formation de LDs dans les macrophages péritonéaux²³. L’utilisation de BODIPY 493/503 a certains avantages par rapport aux autres colorants de lipides neutres comme du Nil rouge. BODIPY 493/503 est hautement spécifique de lipides neutres et a un spectre d’émission étroit, facilitant la détection simultanée de signaux de colorants comme protéine fluorescente rouge ou Mito-tracker, lorsque les échantillons sont analysés par microscopie confocale. Malheureusement, BODIPY 493/503 est sensible au photoblanchiment, mais ce processus peut être évité en utilisant un réactif antiquenching pendant l’exposition à la lumière de²⁴.

Pour exécuter le test LFR dans les cellules de levure, ils sont cultivés dans les conditions nutritionnelles souhaitées et parties aliquotes sont retirés à des moments différents. Ensuite, les cellules sont fixées avec du formaldéhyde, qui préserve l’intégrité du LDs pendant des mois quand les cellules sont stockés à 4 ° C. Autres techniques de fixation doivent être évités, surtout ceux à l’aide de méthanol ou l’acétone froid, puisqu’ils conduisent à la dégradation de LDs dans les cellules²⁴. Pour mesurer l’indice de LD, formaldéhyde-correction des cellules sont en suspension dans l’eau pour obtenir une concentration définie. Ensuite, ils sont ajoutés à une solution contenant le fluorophore BODIPY 493/503 piégée par KI, et lorsque le fluorophore pénètre dans la cellule et l’associe avec les LDs, il y a une reprise de la fluorescence. Concomitante à la mesure de la fluorescence (485 nm/510 nm), la concentration des cellules est quantifiée par la mesure de la densité optique à 600 nm. Chaque échantillon est lu quatre fois en ajoutant ultérieur 5 µL d’extraits d’une suspension de cellules de formaldéhyde-correction pour le même bien. Flans de fluorescence et d’absorbance sont acquises avant l’ajout de cellules. La qualité de la fluorescence et les données d’absorbance sont évaluées en déterminant la linéarité des mesures : si r < 0,9, les données sont ignorées. La valeur de r est importante, parce que fondamentalement, l’intensité de fluorescence doit produire une réponse linéaire à des concentrations croissantes de cellule. Si la concentration en cellules est trop élevée, la linéarité est perdue. Le dosage de la LFR fournit une méthode simple, rapide et économique pour sélectionner le phénotype LD souhaité dans les expériences de haut débit. Après avoir sélectionné les conditions souhaitées, le contenu de la LD de cellules individuelles peut être étudié en microscopie confocale, utilisant les mêmes cellules de formaldéhyde-correction teintés avec BODIPY, fournissant une image des LDs dans la cellule. Leurs balises et le contenu SE peuvent maintenant être davantage analysés par chromatographie sur couche mince.

Protocol

1. préparation des tampons et Solutions Pour préparer 1 L de phosphate buffered saline (PBS, pH 7), dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 dans 800 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 7.0 avec HCl et puis ajouter l’eau pour un volume final de 1 L. PBS peut être fait comme un 10 x solution mère et stocké à température ambiante. Pour préparer 10 mL de solution de fixation, ajouter 1 mL de 37 % de formaldéhyde da…

Representative Results

RAL, avec BODIPY 493/503 comme la sonde fluorescente est une méthode simple et fiable pour étudier l’accumulation dynamique de LDs dans U. maydis, peu importe les conditions de croissance. Lorsque les cellules sont cultivées en milieu YPD, il y avait une augmentation de l’indice de LD durant la phase exponentielle, suivie d’un déclin dans la phase stationnaire (Figure 2 a). En revanche, chez les cellules cultivées sous azotée, il y avait …

Discussion

LFR est une nouvelle méthode qui a été appliquée pour la première fois d’étudier le métabolisme lipidique chez S. cerevisiae et plus tard il a été mis en place dans U. maydis^20,21. Bien que l’index LD ne donne pas une valeur absolue des balises accumulés dans les cellules, il fournit une idée rapide de la teneur en lipides des cellules, et l’interprétation des données est simple lorsqu’on compare les index de LD dans deux ou…

Materials

Spectrophotometer	Varioskan Lux multimode microplate reade	D5879	Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar	Corning Inc.	3615	96 well black-wall/clear bottom
Plate costar	Corning Inc	3598	96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503	Invitrogen/ Thermofisher	D3922	4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution	Sigma Aldrich	252549	ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide	Sigma Aldrich	60399	BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis	ATCC	201384	Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride	Sigma Aldrich	746398	ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	ACS reagent
Select Yeast Extract	Sigma Aldrich	Y100	Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus	Sigma aldrich	N4642	Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose	Sigma Aldrich	G-8270	D (+) glucose
Skaker flask	Pirex	CLS4450250-6EA	Borosiicate glass
Shaker	SEV México	INO650V-7	Orbital shaker
Centrifuge table	Eppendorf	5415C	Centrifuge
Microtubes	Sigma Aldrich	Z606340	Eppendorf
Pipet tips	Axygen scientific	T-200-Y	Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette	Biohit	725130	8 channels, volume range 5-100 uL