Lipid dizin belirlenmesi mantar patojen Ustilago Maydis sıvı Floresans kurtarma tarafından
Summary
Burada, triacylglycerols hücrelerdeki yüksek üretilen iş deneylerde kültürlü dinamiklerini incelemek için lipid damlacık dizin (LD dizini) elde etmek için bir protokol açıklayın. LD dizin tahlil BODIPY 493/503 kullanır kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Bu tahlil dispendious lipid çekme ya da mikroskobu analiz ihtiyacı yok.
Abstract
Makale, triacylglycerols (Etiketler) lipid damlacıkları (LDs) birikimi belirlemek için bir hassas Mikroplaka tahlil LD dizin tahlil uygulamak gösterilmiştir. LD dizin lipid ayıklama elde edilir. O LDs içeriği zengin büyüme veya azot tükenmiş medya gibi farklı koşullar altında yüksek üretilen iş deneylerde ölçüm sağlar. Yöntem Saccharomyces cerevisiae, lipid damlacık metabolizmasında çalışmaya ilk kez açıklanan olsa basidiomycete Ustilago maydisbaşarıyla uygulandı. İlginçtir, ve LDs filogenetik korunmuş ökaryotik hücrelerde organellerin olduğundan, yöntem hücreleri, büyük bir çeşitlilik için Maya memeli hücreleri için uygulanabilir. LD dizin sıvı Floresans kurtarma tahlil (LFR) üzerinde su verme koşullarda BODIPY 493/503. formaldehit ile sabit hücreleri eklenmesiyle dayanmaktadır Potasyum iyot Floresans içki kullanılır. Floresan ve optik yoğunluk yamaçlar arasındaki oran LD dizin adı verilmiştir. Yamaçları ne zaman elde edilen düz çizgiler hesaplanan BODIPY floresan ve optik yoğunluk 600 nm (OD600) örnek ek karşı çizilen. En iyi veri kalitesi korelasyon katsayıları eşit veya 0,9 (r ≥ 0,9) yukarıda yansıtılır. Birden çok örneği aynı anda bir Mikroplaka uygulanabilir gibi okuyabilirsiniz. BODIPY 493/503 lipofilik bir floresan boya o bölümleri lipid damlacıkları olduğundan, LDs birikir hücreleri birçok türleri kullanılabilir.
Introduction
Lipid damlacıkları (LDs) her yerde birden bulunan hücre içi yağ nötr lipitler, esas olarak Etiketler ve sterol esterler (SE) özünü oluşan organlarıdır. Çekirdek perilipin ve enzim diacylglycerol açil transferaz, acetyl-CoA carboxylase ve asil-CoA synthase1gibi nötr lipitler sentezi yer gibi proteinler ile etkileşim bir monolayer fosfolipitler, çevrilidir. Dinamik davranış nedeniyle, Fosfolipid monolayer Etiketler ve SE2hidrolize triacylglycerol lipaz da içerir. Bağlı olarak hücre tipi ve organizma, saklı nötr lipitler enerji üretmek için kullanılabilir veya fosfolipitler ve sinyal molekülleri sentez. Maya ve diğer Mantarlar, yanıt olarak azot/karbon oranı düşük azot durumu tarafsız lipid üretim3,4 artırmak için anahtar olabilir gösteren kültür medyada değişimler LDs içeriğini değiştirir ,5. Yüksek miktarlarda Etiketler Maya üretimi bir potansiyel biyoteknoloji biyoyakıt ve gıda sektöründe kaynak olarak kullanıldı. Saklı bazı yağlar omega 3 ve omega 6, beslenme ve diyet önemi 6,7,8,9,10 ile gibi çoklu doymamış yağ asitleri yüksek oranlarda içerir , 11. insan hücreleri de dahil olmak üzere memeli hücrelerinin LDs de içeren Etiketler ve kolesterol esterleri. Fosfolipid monolayer Maya LDs açıklanan proteinlerin homolog memeli ile ek bir protein yoktur perilipin ile etkileşim S. cerevisiae12. Bir rol Fosfolipid monolayer ve onun ilişkili proteinler için LDs yapısı stabilize etmek ve etkileşime LDS organelleri mitokondri, endoplazmik retikulum, tanımladıkları ve çarpıtmalar, esas olarak lipid değişimi için izin vermek için önerilen 13,14. İlginçtir ki, insanlarda, LDs patolojiler tip 2 diyabet, ateroskleroz, steatohepatitis ve Koroner kalp hastalığı, onların sayı 15,16,17 bir artış olduğu gibi yer gibi görünüyor . Biraz tip-in virüs LDs platformlar virions 2,18,19düzenlemek için kullanın.
İnsan patolojiler ve potansiyel Biyoteknolojik kullanımları LDS’de etkileri nedeniyle, LDs oluşumu tam deneysel belirlenmesi önemli bir görevdir. Bu makalede, floresan (LFR) BODIPY 493/503 kurtarma üzerinde dayalı güvenilir bir tahlil (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), hücrelerinde nötr lipitler içeriğini göreli değerini almak için. Bu tahlil ile nötr lipitler mantarlar U. maydis ve S. cerevisiaegibi ve aynı zamanda lipid ayıklama 20. , gerek kalmadan memeli hücrelerinde birikimi dinamikleri takip etmek mümkündür S. cerevisiae protein fosfatazlar tanımlamak için ilk kez yöntemi uygulandı ve söz konusu olursa kinaz lipid metabolizma düzenlenmesi. Bu lipid çekme ya da protein saflaştırma21,22mümkün oldu. LFR da LDs oluşumu Periton makrofajlar23yılında dinamikleri kurmak için kullanılmıştır. Kullanım BODIPY 493/503 Nil kırmızı diğer tarafsız lipid boyalar üzerinde bazı avantajları vardır. BODIPY 493/503 nötr lipitler için çok özel ve dar bir emisyon spektrum örnekleri tarafından confocal mikroskobu analiz edilir zaman boyalar gibi kırmızı floresan protein veya Mito-izci, gelen sinyalleri eşzamanlı algılama kolaylaştırmak. Ne yazık ki, BODIPY 493/503 photobleaching için hassas olduğunu, ancak bu işlem sırasında hafif24maruz antiquenching bir reaktif kullanarak önlenebilir.
Maya hücreleri LFR tahlil yapmak, onlar istenen beslenme koşulları altında kültürlü ve aliquots farklı zamanlarda çekilmiş. Daha sonra hücreler ne zaman hücreleri 4 ° C’de depolanan ay LDs bütünlüğünü korur formaldehit ile giderilen Diğer fiksasyon teknikleri, özellikle de onlar LDs bozulması hücreleri24içinde yol beri metanol veya soğuk aseton kullanarak kaçınılmalıdır. LD dizin ölçmek için hücreleri formaldehit sabit su içinde tanımlanmış bir konsantrasyon elde etmek için askıya alınır. Sonra fluorophore BODIPY 493/503 KI tarafından su içeren bir çözüm eklenir ve fluorophore hücreye girer ve LDs ile ilişkilendirir zaman onun Floresans kurtarılması yoktur. Floresans ölçüme (485 nm/510 nm) eşlik eden, hücre konsantrasyonu 600 optik yoğunluk ölçerek sayılabilir nm. Her örnek sonraki 5 µL aliquots formaldehit sabit hücre süspansiyon, sizin için de ekleyerek dört kere okunur. Boşlukları Absorbans ve floresan hücreleri toplamadan önce elde edilir. Floresan ve Absorbans veri kalitesi ölçümleri doğrusallık belirlenerek değerlendirilir: Eğer r < 0,9, veri atılır. R değeri önemli çünkü temelde floresan yoğunluğu artan hücre konsantrasyonları doğrusal bir yanıt üretmek gerekir. Hücre konsantrasyonu çok yüksek ise, doğrusallık kaybolur. LFR tahlil istenen LD fenotip yüksek üretilen iş deneylerde seçmek için hızlı, basit ve ekonomik bir yöntemdir. İstediğiniz koşulları seçtikten sonra tek tek hücreleri LD içeriğini confocal mikroskobu, BODIPY, hücre LDS'de görüntüsünü sağlayan ile lekeli aynı formaldehit sabit hücreleri kullanarak tarafından ele. Onların Etiketler ve SE içeriği şimdi daha da ince tabaka Kromatografi tarafından çözümlenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
LFR başarıyla yapıldı lipid metabolizma S. cerevisiae ve daha sonra eğitim ilk kez uygulanan bir yöntemdir roman U. maydis20,21‘ uygulanmaktadır. LD dizin hücrelerinde birikmiş Etiketler mutlak değerini vermek değil rağmen hücre lipid içeriği hakkında hızlı bir fikir sağlar ve ne zaman iki veya daha fazla deneysel koşullar dizinden LD karşılaştırılır verilerin yorumlanması basittir. BODIPY 493/503 nötr lipitler, LDs a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe tarafından desteklenen Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-YUDUM-20170864), Programa de Apoyo Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-Universidad Nacional Autonoma de México () UNAM) ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP ve 256520-yumurta). Fundação de Amparo bir Pesquisa yapmak Rio de Janeiro (FAPERJ-Cientistas Nosso Estado yapın: E 26/103.353/2011). Biz QFB sayesinde. Oscar Iván Luqueño Bocardo şematik genel bakış. Biz Dr Miguel Tapia Rodríguez LDS confocal mikroskobu değerli yardım için teşekkür ederim. Dr. Bruno Bozaquel Morais U. maydisiçin uyarlanmış S. cerevisiae teknikte gelişmekte olan öncü çalışmaları için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Spectrophotometer | Varioskan Lux multimode microplate reade | D5879 | Filter 493/503 or monochromator detector |
| Plate costar | Corning Inc. | 3615 | 96 well black-wall/clear bottom |
| Plate costar | Corning Inc | 3598 | 96 well cell culture plate costar |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen/ Thermofisher | D3922 | 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | 252549 | ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization |
| Potassium iodide | Sigma Aldrich | 60399 | BioUltra, ≥ 99.5% (AT) |
| FB2 Ustilago maydis | ATCC | 201384 | Basidiomycete-Yeast |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 746398 | ACS reagent, inorganic salt |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | ACS reagent |
| Select Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y100 | Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media |
| N-Z case plus | Sigma aldrich | N4642 | Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk |
| Glucose | Sigma Aldrich | G-8270 | D (+) glucose |
| Skaker flask | Pirex | CLS4450250-6EA | Borosiicate glass |
| Shaker | SEV México | INO650V-7 | Orbital shaker |
| Centrifuge table | Eppendorf | 5415C | Centrifuge |
| Microtubes | Sigma Aldrich | Z606340 | Eppendorf |
| Pipet tips | Axygen scientific | T-200-Y | Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile |
| mLine pipette | Biohit | 725130 | 8 channels, volume range 5-100 uL |
Referências
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
- Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
- Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
- Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
- Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
- Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
- Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
- Kolouchova, I., Mat’atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
- Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
- Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
- Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
- Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
- Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
- Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
- Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
- Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
- Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
- Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
- Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
- Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
- Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Holliday, R., King, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. , 575-595 (1974).
