Lipid-Index Bestimmung von flüssigen Fluoreszenz Erholung der pilzliche Erreger Ustilago Maydis

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um der Lipid-Tröpfchen (LD Index) erreichen, um die Dynamik der Triacylglyzerole in Zellen im Hochdurchsatz-Experimente zu studieren. Die LD-Index-Assay ist eine einfache und zuverlässige Methode, die BODIPY 493/503 verwendet. Dieser Assay benötigt keine Dispendious Lipid-Extraktion oder Mikroskopie-Analyse.

Abstract

Der Artikel zeigt, wie die LD-Index-Assay, implementieren, die eine sensible Mikrotestplatte Assay zu bestimmen, die Anhäufung von Triacylglyzerole (TAGs) in Lipid-Tröpfchen (LDs) ist. LD-Index wird ohne Lipid-Extraktion gewonnen. Es ermöglicht die Messung des LDs-Inhalts im Hochdurchsatz-Experimente unter verschiedenen Bedingungen wie Wachstum im Reich oder Stickstoff aufgebraucht Medien. Wenn auch die Methode zum ersten Mal den Fettstoffwechsel von Tröpfchen in Saccharomyces Cerevisiae, studieren beschrieben wurde war es erfolgreich auf Basidiomycete Ustilago Maydisangewendet. Interessant ist, und weil LDs Zellorganellen in eukaryotischen Zellen phylogenetisch konserviert sind, kann die Methode auf eine Vielzahl von Zellen, von Hefe für Säugerzellen angewendet werden. Der LD-Index basiert auf der flüssigen Fluoreszenz Erholung Assay (LFR) von BODIPY 493/503 abschrecken Bedingungen durch die Zugabe von Zellen mit Formaldehyd_. fixiert Kalium-Jod dient als ein Fluoreszenz-Durstlöscher. Das Verhältnis zwischen der Fluoreszenz und die optische Dichte Hänge ist LD Index benannt. Neigungen werden berechnet von den geraden Linien erreicht, wenn BODIPY Fluoreszenz und Extinktion bei 600 nm (OD₆₀₀) werden gegen Probe zusätzlich dargestellt. Optimale Datenqualität spiegelt sich durch Korrelationskoeffizienten gleich oder über 0,9 (R ≥ 0,9). Mehrere Proben können gleichzeitig gelesen werden, wie es in einer Mikrotestplatte umgesetzt werden kann. Da BODIPY 493/503 eine lipophile Leuchtstoff färben die Partitionen in der Lipid-Tröpfchen ist, kann es in vielen Arten von Zellen verwendet werden, die Kirche Jesu Christi zu sammeln.

Introduction

Lipid-Tröpfchen (LDs) sind allgegenwärtige intrazellulären Fett Körper, bestehend aus einem Kern von neutralen Lipiden, vor allem TAGs und Sterol Ester (SE). Der Kern ist umgeben von einer Monoschicht von Phospholipiden, die mit Proteinen wie Perilipin und Enzyme beteiligt an der Synthese von neutralen Lipiden, wie Diacylglycerol Acyl-Transferase, Acetyl-CoA Carboxylase und Acyl-CoA-Synthase-¹interagiert. Durch sein dynamisches Verhalten enthält die Phospholipid-Monolayer auch Triacylglycerol Lipasen, die TAGs und SE²Hydrolyseneigung. Je nach Zelltyp und Organismus gespeicherten neutralere Lipiden können verwendet werden, um Energie zu erzeugen, oder synthetisieren Phospholipide und Signalmoleküle. In Hefen und anderen Pilzen ändert den Inhalt des LDs in Reaktion auf eine sich ändernde Stickstoff/Kohlenstoff-Verhältnis in Kulturmedien, darauf hinweist, dass verminderte Stickstoffverfügbarkeit möglicherweise der Schlüssel zu neutral Lipid Produktion^{3,4 zu erhöhen ,5}. Die Produktion von hohen Mengen von TAGs in der Hefe hat eine mögliche Verwendung in der Biotechnologie als Quelle von Biokraftstoffen und in der Lebensmittelindustrie. Einige gespeicherte Lipide enthalten hohe Anteile an mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Omega-3 und Omega-6, mit Ernährungs- und diätetische Bedeutung ^{6,7,8,9,10 , 11}. LDs von Säugerzellen, einschließlich der menschlichen Zellen enthalten auch TAGs und Cholesterin-Ester. Die Phospholipid-Monolayer interagiert mit den Säugetieren homologe Proteine, die in der Hefe LDs beschrieben und mit einem zusätzlichen Protein, Perilipin, der abwesend ist in S. Cerevisiae¹². Eine vorgeschlagene Rolle für die Phospholipid-Monolage und seiner damit verbundenen Proteine, die LDs-Struktur zu stabilisieren und damit die Interaktion von LDs mit Organellen als endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, Peroxisomen und Vakuolen, vor allem für Lipid Austausch ^{ist 13,14}. Interessanterweise scheinen beim Menschen, LDs Krankheiten wie Typ-2-Diabetes, Arteriosklerose, Steatohepatitis und koronare Herzkrankheit, in dem gibt es eine Zunahme der Zahl ^{15,16,17 beteiligt sein} . Einige Arten von Viren nutzen LDs als Plattformen zusammenzubauen Virionen ^2,18,19.

Aufgrund der Auswirkungen der lokalen Entwicklungsstrategie in menschliche Pathologien und deren biotechnologische Einsatzmöglichkeit ist die genaue experimentelle Bestimmung der LDs-Bildung eine wichtige Aufgabe. Dieser Artikel beschreibt eine zuverlässige Assays basierend auf die Erholung der Fluoreszenz (LFR) von BODIPY 493/503 (4, 4-Difluoro-1, 3, 5, 7, 8-Pentamethyl-4-Bora-3a, 4a-Diaza-s-Indacene), um einen relativen Wert des Inhalts der neutrale Lipide in den Zellen zu bekommen. Mit diesem Test ist es möglich, die Dynamik der Anhäufung von neutralen Lipiden in Pilzen wie U. Maydis und S. Cerevisiae, und auch in Säugetierzellen, ohne die Notwendigkeit von Lipid-Extraktion ²⁰. folgen Die Methode angewendet wurde, zum ersten Mal in S. Cerevisiae zu identifizieren, die Protein-Phosphatasen und Kinasen beteiligt die Regulierung des Fettstoffwechsels. Dies war möglich ohne Lipid-Extraktion oder Protein Reinigung^21,22. LFR wurde auch verwendet, um die Dynamik der LDs-Formation im peritonealen Makrophagen²³zu etablieren. Die Verwendung von BODIPY 493/503 hat einige Vorteile gegenüber anderen neutral Lipid-Farbstoffe als Nil rot. BODIPY 493/503 ist hochspezifisch für neutrale Lipide und hat einen schmalen Emissionsspektrum erleichtern die simultane Detektion der Signale von Farbstoffen wie rot fluoreszierende Protein oder Mito-Tracker, wenn die Proben durch konfokale Mikroskopie analysiert werden. Leider BODIPY 493/503 ist empfindlich gegenüber Immunofluoreszenz, aber dieser Prozess kann mithilfe einer antiquenching Reagenz während der Exposition gegenüber Licht²⁴vermieden werden.

Zur Durchführung der LFR Assay in Hefezellen, sie sind unter den gewünschten Ernährungs-Bedingungen kultiviert und Aliquote sind zu unterschiedlichen Zeitpunkten zurückgezogen. Als nächstes werden Zellen mit Formaldehyd, fixiert, die die Integrität des LDs monatelang bewahrt wenn Zellen bei 4 ° c gelagert werden Ndere Fixierung sollte vermieden werden, vor allem diejenigen, die mit Methanol oder kaltem Aceton, da sie zum Abbau der LDs innerhalb der Zellen²⁴führen. Um den LD-Index zu messen, sind Formaldehyd-feste Zellen im Wasser zu einer definierten Konzentration ausgesetzt. Dann werden sie zu einer Lösung mit der Fluorophor BODIPY 493/503 abgeschreckt durch KI hinzugefügt, und wenn der Fluorophor die Zelle betritt und die LDs ordnet, gibt es eine Erholung der seine Fluoreszenz. Begleitende der Fluoreszenz-Messung (485 nm/510 nm), die Konzentration der Zellen wird quantifiziert durch die Messung der optischen Dichte bei 600 nm. Jede Probe wird viermal gelesen, indem nachfolgende 5 µL Aliquots Formaldehyd fixiert Zellsuspension zu gleich gut. Rohlinge von Fluoreszenz und Absorption sind vor der Zugabe von Zellen erworben. Die Qualität der Fluoreszenz und die Extinktion-Daten werden durch die Bestimmung der Linearität der Messungen ausgewertet: Wenn R < 0.9, Daten werden verworfen. Der R-Wert ist wichtig, weil im Grunde die Intensität der Fluoreszenz eine lineare Reaktion auf steigenden Zelle Konzentrationen produzieren sollte. Wenn die Zellkonzentration zu hoch ist, ist die Linearität verloren. Der LFR-Test bietet eine schnelle, einfache und wirtschaftliche Methode, um wählen die gewünschte LD-Phänotyp im Hochdurchsatz-Experimente. Nach der Auswahl der gewünschten Bedingungen, kann der LD-Inhalt der einzelnen Zellen durch konfokale Mikroskopie, Verwendung der gleichen Formaldehyd-feste Zellen befleckt mit BODIPY, bietet ein Bild von der Kirche Jesu Christi in der Zelle untersucht werden. Ihre TAGs und SE Inhalte können jetzt weiter durch Dünnschichtchromatographie analysiert werden.

Protocol

1. Vorbereitung der Puffer und Lösungen Zur Vorbereitung von 1 L Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7), 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 in 800 mL distillated Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit HCl, und fügen Sie Wasser für ein Endvolumen von 1 L. PBS als ein 10 x-Stammlösung und bei Raumtemperatur gelagert werden kann. Fügen Sie 1 mL 37 % Formaldehyd um 10 mL der Lösung Befestigung vorzubereiten hinzu, 9 …

Representative Results

LFR, mit BODIPY 493/503 als fluoreszierende Sonde ist eine zuverlässige und einfache Methode, der dynamische Ansammlung von LDs in U. Maydis, unabhängig davon die Wachstumsbedingungen zu studieren. Wenn Zellen in YPD-Medium kultiviert wurden, gab es eine Zunahme der LD-Index in der exponentiellen Phase, gefolgt von einem Rückgang in der stationären Phase (Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu gab es in den Zellen unter Stickstoff Hunger gewachsen, ein…

Discussion

LFR ist eine neuartige Methode, die angewendet wurde, zum ersten Mal um den Fettstoffwechsel in S. Cerevisiae und später zu studieren, es erfolgreich war, umgesetzt U. Maydis^20,21. Obwohl der LD-Index keinen absoluten Wert der Variablen in Zellen angesammelt geben, freuen Sie sich auf einen schnellen Überblick der Lipidgehalt der Zellen und die Interpretation der Daten ist einfach, wenn LD Index von zwei oder mehr experimentellen Bedingungen v…

Materials

Spectrophotometer	Varioskan Lux multimode microplate reade	D5879	Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar	Corning Inc.	3615	96 well black-wall/clear bottom
Plate costar	Corning Inc	3598	96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503	Invitrogen/ Thermofisher	D3922	4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution	Sigma Aldrich	252549	ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide	Sigma Aldrich	60399	BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis	ATCC	201384	Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride	Sigma Aldrich	746398	ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	ACS reagent
Select Yeast Extract	Sigma Aldrich	Y100	Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus	Sigma aldrich	N4642	Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose	Sigma Aldrich	G-8270	D (+) glucose
Skaker flask	Pirex	CLS4450250-6EA	Borosiicate glass
Shaker	SEV México	INO650V-7	Orbital shaker
Centrifuge table	Eppendorf	5415C	Centrifuge
Microtubes	Sigma Aldrich	Z606340	Eppendorf
Pipet tips	Axygen scientific	T-200-Y	Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette	Biohit	725130	8 channels, volume range 5-100 uL