Определение липидов индекс путем восстановления жидкого флуоресценции в грибкового патогена Пузырчатая Maydis
Summary
Здесь мы описываем протокол для получения липидного капель индекс (LD) для изучения динамики триацилглицеролов в клетки культивировали в высок объём экспериментов. Assay индекс LD-это простой и надежный метод, который использует BODIPY 493/503. Этот assay не нужно dispendious экстракции липидов или анализа в микроскопии.
Abstract
В статье показано как реализовать пробирного LD индекс, который является чувствительной Гонав пробирного определить накопление триацилглицеролов (Теги) в капельках липидов (LDs). LD индекс получается без экстракции липидов. Это позволяет измерения содержания LDs в высок объём экспериментов в различных условиях, таких как рост в богатых или азота в исчерпаны средства массовой информации. Хотя этот метод был описан в первый раз для изучения капелька метаболизма липидов в Saccharomyces cerevisiae, он был успешно применен к базидиомицета пузырчатая maydis. Интересно и потому, что LDs являются органеллы, филогенетически сохраняется в эукариотических клетках, метод может быть применен к большое количество клеток, от дрожжевых клеток млекопитающих. LD индекс основан на пробу восстановления жидкого флуоресценции (LFR) BODIPY 493/503 тушения условиях путем добавления ячеек фиксированной с формальдегидом. Калий йод используется как флуоресценции утоления. Соотношение между флуоресценции и склонах оптической плотности называется LD индекс. Склоны вычисляются из прямых линий, полученных при BODIPY флуоресценции и оптическая плотность 600 Нм (600OD) заговор против добавления образца. Оптимального качества отражается коэффициенты корреляции равной или выше 0,9 (r ≥ 0.9). Несколько образцов можно читать одновременно, как он может быть реализован в микроплиты. Поскольку BODIPY 493/503 липофильных флуоресцентных красителей что разделы в капелек липидов, она может использоваться во многих типах клеток, которые аккумулируют LDs.
Introduction
Липидного капель (LDs) являются повсеместно внутриклеточного жира тела состоит из ядра нейтральные липиды, главным образом Теги и эфиры стеринов (SE). Ядро окружен монослоя фосфолипидов, который взаимодействует с белками, как perilipin и ферментов, участвующих в синтезе нейтральные липиды, например диацилглицерол ацил трансферазы, ацетил-КоА carboxylase и дефицит ацил CoA синтазы1. Из-за его динамическое поведение фосфолипидный монослоя также содержит триацилглицеринов липазы которые гидролизуют Теги и SE2. В зависимости от типа клеток и организм хранимые нейтральные липиды могут использоваться для получения энергии, или синтезировать фосфолипидов и сигнальных молекул. Дрожжи и другие грибки, содержание LDs изменения в ответ на изменения в коэффициент азота/углерода в культуре средств массовой информации, указав, что наличие снижение азота может быть ключом к увеличению липидный нейтральными производства3,4 ,5. Производство большое количество тегов в дрожжи имеет потенциального использования в биотехнологии как источника биотоплива и в пищевой промышленности. Некоторые хранимые липиды содержат высокие пропорции полиненасыщенных жирных кислот, как Омега 3 и Омега 6, с питания и диетических значение 6,,78,9,10 , 11. LDs mammalian клеток, включая клетки человека, также содержат теги и эфиры холестерина. Фосфолипидный монослоя взаимодействует с млекопитающих гомологичных белков, описанных в дрожжи LDs и с дополнительного белка, perilipin, который отсутствует в S. cerevisiae12. Один предложил, что роль для его связанного белков и фосфолипидов монослоя стабилизации структуры LDs и разрешить взаимодействие LDs с органеллы митохондрии, эндоплазматический ретикулум, пероксисомы и вакуоли, главным образом для липидного обмена 13,14. Интересно, что в организме человека, LDs, как представляется, быть вовлечены в патологии как тип 2 диабета, атеросклероза, стеатогепатит и ишемической болезни сердца, в котором есть увеличение их числа в 15,16,17 . Некоторые типы вирусов использовать LDs как платформы для сборки вирионы 2,18,19.
Из-за последствий LDs в человеческой патологии и их потенциального использования биотехнологических точного экспериментального определения формирования LDs является важной задачей. Эта статья описывает надежного анализа на основе восстановления флюоресценция (LFR) BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-бора 3А, 4а диазафенантрена s-indacene), чтобы получить значение относительного содержания нейтральные липиды в клетках. С этот assay можно проследить динамику накопления нейтральные липиды в грибы как U. maydis и S. cerevisiae, а также в клетках млекопитающих, без необходимости извлечения липидов в 20. Метод был применен для в первый раз в S. cerevisiae для идентификации белковых фосфатаз и киназы, участвующих в регуляции жирового обмена. Это стало возможным без экстракции липидов и белков очистки21,22. LFR также использовался для создания динамики формирования LDs в перитонеальных макрофагов23. Использование BODIPY 493/503 имеет некоторые преимущества над другими красителями нейтральных липидов как красный Нила. BODIPY 493/503 весьма специфичен для нейтральные липиды и имеет узкий спектр излучения, облегчения одновременного обнаружения сигналов от краски как красный флуоресцирующий белок или Mito трекер, когда анализируются образцы confocal микроскопии. К сожалению BODIPY 493/503 чувствителен к Фотообесцвечивание, но этот процесс можно избежать с помощью antiquenching реагента при воздействии света24.
Для проведения пробирного LFR в дрожжевых клеток, они культивировали в желаемый питания условиях, и аликвоты снимаются в разное время. Далее клетки фиксируются с формальдегидом, который сохраняет целостность LDs для месяцев, когда клетки хранятся при 4 ° C. Другие методы фиксации следует избегать, особенно те, с использованием метанола или холодной ацетона, поскольку они ведут к деградации LDs внутри клетки24. Для измерения индекса LD, формальдегида Исправлена клетки подвешены в воде для получения определенной концентрации. Затем они добавляются в раствор, содержащий Флюорофор BODIPY 493/503 закаленном KI, и когда Флюорофор входит в ячейку и связывает с LDs, является восстановление ее флуоресценции. Сопутствующих измерений флуоресценции (485 Нм/510 нм), концентрация клеток количественно измеряя оптическую плотность 600 Нм. Каждый образец читается в четыре раза, добавив последующие 5 мкл аликвоты формальдегида Исправлена клеток подвески к тому же хорошо. Бланки флуоресценции и поглощения приобретаются перед добавлением клеток. Качество флуоресценции и поглощения данные оцениваются путем определения линейность измерений: если r < 0.9, данные отбрасываются. Значение r имеет важное значение, потому что в основном интенсивность флуоресценции должен производить линейным откликом на увеличение концентрации клеток. Если клетки концентрация слишком высока, линейность теряется. LFR assay обеспечивает быстрый, простой и экономичный метод для выбора желаемого фенотип LD в высок объём экспериментов. После выбора желаемых условий, LD содержание отдельных ячеек может быть изучен конфокальная микроскопия, используя те же формальдегида Исправлена клетки окрашивали BODIPY, обеспечивая образ LDs в ячейке. Теги и их SE содержания могут теперь далее анализироваться хромотографией тонким слоем.
Protocol
Representative Results
Discussion
LFR это новый метод, который был применен в первый раз для изучения жирового обмена в S. cerevisiae и позднее было успешно реализовано в U. maydis20,21. Хотя индекс LD не абсолютное значение тэгов, накапливается в клетках, он обеспечивает быстрый идея содержани…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана от грантов Instituto Nacional-Secretaria политехнического де инвестигасьон и Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo де инвестигасьон Proyectos e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México ЮНАМ) и Consejo Nacional de науки y Tecnología (КОНАСИТ 254904-JPP и 256520-GGS). Фонд-де-ампаро Pesquisa делать Рио-де-Жанейро (FAPERJ-Cientistas делать Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Мы благодаря QFB. Оскар Иван Лукеньо Bocardo Схематический обзор. Мы благодарим д-р Мигель Родригес Тапиа за ценную помощь в конфокальной микроскопии LDs. Мы хотели бы поблагодарить д-р Бруно Bozaquel Morais за его новаторскую работу по разработке технику в S. cerevisiae , что мы адаптировали для U. maydis.
Materials
| Spectrophotometer | Varioskan Lux multimode microplate reade | D5879 | Filter 493/503 or monochromator detector |
| Plate costar | Corning Inc. | 3615 | 96 well black-wall/clear bottom |
| Plate costar | Corning Inc | 3598 | 96 well cell culture plate costar |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen/ Thermofisher | D3922 | 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | 252549 | ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization |
| Potassium iodide | Sigma Aldrich | 60399 | BioUltra, ≥ 99.5% (AT) |
| FB2 Ustilago maydis | ATCC | 201384 | Basidiomycete-Yeast |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 746398 | ACS reagent, inorganic salt |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | ACS reagent |
| Select Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y100 | Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media |
| N-Z case plus | Sigma aldrich | N4642 | Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk |
| Glucose | Sigma Aldrich | G-8270 | D (+) glucose |
| Skaker flask | Pirex | CLS4450250-6EA | Borosiicate glass |
| Shaker | SEV México | INO650V-7 | Orbital shaker |
| Centrifuge table | Eppendorf | 5415C | Centrifuge |
| Microtubes | Sigma Aldrich | Z606340 | Eppendorf |
| Pipet tips | Axygen scientific | T-200-Y | Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile |
| mLine pipette | Biohit | 725130 | 8 channels, volume range 5-100 uL |
Referências
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
- Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
- Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
- Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
- Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
- Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
- Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
- Kolouchova, I., Mat’atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
- Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
- Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
- Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
- Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
- Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
- Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
- Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
- Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
- Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
- Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
- Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
- Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
- Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Holliday, R., King, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. , 575-595 (1974).
