Determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso Ustilago Maydis

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l’indice di gocciolina del lipido (indice di LD) per studiare la dinamica dei triacilgliceroli in cellule coltivate in esperimenti di alto-rendimento. Il dosaggio di indice di LD è un metodo facile e affidabile che utilizza BODIPY 493/503. Questo test non necessita di estrazione lipidica dispendious o analisi di microscopia.

Abstract

L’articolo viene illustrato come implementare l’analisi di indice di LD, che è un test sensibile micropiastra per determinare l’accumulo di trigliceridi (tag) in goccioline del lipido (LDs). Indice di LD è ottenuto senza estrazione lipidica. Esso permette di misurare il contenuto di LDs negli esperimenti di alto-rendimento in condizioni diverse, come la crescita in ricchi o media di azoto impoverito. Anche se il metodo è stato descritto per la prima volta di studiare il metabolismo di gocciolina del lipido in Saccharomyces cerevisiae, è stato applicato con successo per il basidiomicete Ustilago maydis. Interessante, e perché LDs sono organelli filogeneticamente conservati nelle cellule eucariotiche, il metodo può essere applicato a una grande varietà di cellule, da lievito per cellule di mammifero. L’indice di LD è basato sull’analisi di recupero liquido di fluorescenza (LFR) di BODIPY 493/503 in condizioni di tempra, con l’aggiunta di cellule fissato con formaldeide_. Lo iodio potassio è usato come un quencher di fluorescenza. Il rapporto fra la fluorescenza e i pendii di densità ottica è denominato indice di LD. Piste sono calcolate da linee rette ottenute quando BODIPY fluorescenza e densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) vengono confrontate con aggiunta dei campioni. Qualità ottimale dei dati si riflette dai coefficienti di correlazione pari o sopra 0,9 (r ≥ 0,9). Campioni multipli possono essere letti contemporaneamente, poiché può essere implementata in una micropiastra. Poiché BODIPY 493/503 è un fluorescente lipofilico tingere che partizioni nelle gocce di lipidi, può essere utilizzato in molti tipi di cellule che si accumulano LDs.

Introduction

Le goccioline del lipido (LDs) sono corpi grassi intracellulari onnipresenti composti da un nucleo di lipidi neutri, principalmente tag ed esteri dello sterolo (SE). Il nucleo è circondato da un monostrato di fosfolipidi che interagisce con le proteine come perilipina ed enzimi coinvolti nella sintesi di lipidi neutri, come il diacilglicerolo acil-transferasi, acetil-CoA carbossilasi e acil-CoA sintasi¹. A causa del suo comportamento dinamico, strato monomolecolare del fosfolipide contiene anche triacilglicerolo lipasi che idrolizzano tag e SE². A seconda del tipo di cellula e l’organismo, stored lipidi neutri possono essere utilizzati per generare energia, o sintetizzano fosfolipidi e molecole di segnalazione. In lieviti e altri funghi, il contenuto di LDs cambia in risposta a variazioni nel rapporto carbonio/azoto in terreni di coltura, che indica che la disponibilità di azoto in diminuzione potrebbe essere la chiave per aumentare la produzione di lipidi neutri^{3,4 ,5}. La produzione di elevate quantità di tag in lievito ha un potenziale impiego in biotecnologia come fonte di biocarburanti e nell’industria alimentare. Alcuni lipidi stored contengono proporzioni elevate degli acidi grassi polinsaturi, come omega 3 e omega 6, con dietetica e nutrizionale ^{6,7,8,9,10 , 11}. LDs di cellule di mammiferi, tra cui le cellule umane, anche contenere tag ed esteri del colesterolo. Il monostrato di fosfolipide interagisce con i mammiferi omologo delle proteine descritto nel lievito LDs e con una proteina supplementare, Perilipina, che è assente in S. cerevisiae¹². Una proposta di ruolo per il monostrato di fosfolipidi e le proteine associate è per stabilizzare la struttura LDs e consentire l’interazione di LDs con organelli come mitocondri, reticolo endoplasmatico, peroxisomes e vacuoli, principalmente per lo scambio dei lipidi ^13,14. È interessante notare che, negli esseri umani, LDs sembrano essere coinvolti in patologie come il diabete di tipo 2, aterosclerosi, steatoepatite e malattia coronarica, in cui vi è un aumento nel loro numero di ^15,16,17 . Alcuni tipi di virus utilizzano LDs come piattaforme per assemblare i virioni ^2,18,19.

Dovuto le implicazioni della SSL in patologie umane e loro potenziale utilizzo biotecnologica, l’esatta determinazione sperimentale della formazione di LDs è un compito importante. Questo articolo descrive un’analisi affidabile basata sul recupero della fluorescenza (LFR) di BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentametil-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), per ottenere un valore relativo del contenuto di lipidi neutri in cellule. Con questa analisi, è possibile seguire le dinamiche dell’accumulo di lipidi neutri in funghi come U. maydis e S. cerevisiaee anche in cellule di mammifero, senza la necessità di lipidi estrazione ²⁰. Il metodo è stato applicato per la prima volta in S. cerevisiae per identificare le proteine fosfatasi e chinasi coinvolte nella regolazione del metabolismo dei lipidi. Ciò era possibile senza estrazione dei lipidi o proteine purificazione^21,22. LFR è stato utilizzato anche per stabilire le dinamiche di formazione di LDs in macrofagi peritoneali²³. L’uso di BODIPY 493/503 ha alcuni vantaggi rispetto ad altri coloranti di lipidi neutri come Nilo rosso. BODIPY 493/503 è altamente specifico per lipidi neutri e con uno spettro di emissione stretto, facilitando la rilevazione simultanea di segnali da coloranti come proteina fluorescente rossa o Mito-Tracking, quando i campioni sono analizzati mediante microscopia confocale. Purtroppo, BODIPY 493/503 è sensibile al photobleaching, ma questo processo può essere evitato utilizzando un reagente antiquenching durante l’esposizione a luce²⁴.

Per eseguire il test LFR in cellule di lievito, che vengono allevati nelle condizioni nutrizionali desiderate, e le aliquote siano revocate in momenti diversi. Successivamente, le cellule sono fissate con formaldeide, che preserva l’integrità della LDs per mesi quando le cellule sono conservate a 4 ° C. Altre tecniche di fissaggio dovrebbero essere evitati, soprattutto quelli che utilizzano metanolo o acetone freddo, poiché conducono alla degradazione di LDs nelle cellule²⁴. Per misurare l’indice di LD, formaldeide-fisso cellule sono sospese in acqua per ottenere una concentrazione definita. Quindi, vengono aggiunti a una soluzione che contiene il fluoroforo BODIPY 493/503 bonificato di KI, e quando il fluoroforo entra nella cella e associa il LDs, c’è una ripresa della sua fluorescenza. Concomitante alla misurazione della fluorescenza (485 nm/510 nm), la concentrazione di cellule è quantificata misurando la densità ottica a 600 nm. Ogni campione viene letto quattro volte con l’aggiunta di successivi 5 aliquote µ l di sospensione cellulare formaldeide-fisso per lo stesso bene. Spazii in bianco di fluorescenza e di assorbanza sono acquisite prima dell’aggiunta delle cellule. La qualità della fluorescenza e i dati di assorbanza sono valutati determinando la linearità delle misurazioni: se r < 0,9, i dati vengono eliminati. Il valore di r è importante perché fondamentalmente l'intensità della fluorescenza deve produrre una risposta lineare a concentrazioni crescenti di cella. Se la concentrazione delle cellule è troppo alta, la linearità viene persa. Il dosaggio LFR fornisce un metodo veloce, semplice ed economico per selezionare il fenotipo desiderato di LD in esperimenti di alto-rendimento. Dopo aver selezionato le condizioni desiderate, il contenuto di LD di singole celle possa essere studiato mediante microscopia confocale, utilizzando le stesse cellule di formaldeide-fisso macchiate con BODIPY, fornendo un'immagine di LDs nella cella. Tag e il loro contenuto SE ora può essere ulteriormente analizzati mediante cromatografia su strato sottile.

Protocol

1. preparazione del buffer e soluzioni Per preparare 1 L di fosfato tampone (PBS, pH 7), sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4, 0,24 g di KH2PO4 in 800 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7.0 con HCl e poi aggiungere acqua per un volume finale di 1 L. PBS può essere fatto come una soluzione di riserva di 10x e conservato a temperatura ambiente. Per preparare 10 mL di soluzione di fissaggio, aggiungere 1 mL di formaldeide al 37% o 9 mL…

Representative Results

LFR, con BODIPY 493/503 come la sonda fluorescente è un metodo semplice e affidabile per studiare l’accumulo dinamico di LDs in U. maydis, a prescindere le condizioni di crescita. Quando le cellule sono state coltivate nel terreno di YPD, c’era un aumento nell’indice LD durante la fase esponenziale, seguito da un declino in fase stazionaria (Figura 2A). Al contrario, in cellule coltivate in fame di azoto, c’era un costante aumento nell’indice di LD …

Discussion

LFR è un nuovo metodo che è stato applicato per la prima volta studiare il metabolismo dei lipidi in S. cerevisiae e versioni successive è stato correttamente implementato in U. maydis^20,21. Anche se l’indice di LD non dà valore assoluto dei tag accumulati nelle cellule, esso fornisce una rapida idea del contenuto lipidico delle cellule, e l’interpretazione dei dati è semplice, quando vengono confrontati con indice di LD da due o più condi…

Materials

Spectrophotometer	Varioskan Lux multimode microplate reade	D5879	Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar	Corning Inc.	3615	96 well black-wall/clear bottom
Plate costar	Corning Inc	3598	96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503	Invitrogen/ Thermofisher	D3922	4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution	Sigma Aldrich	252549	ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide	Sigma Aldrich	60399	BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis	ATCC	201384	Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride	Sigma Aldrich	746398	ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	ACS reagent
Select Yeast Extract	Sigma Aldrich	Y100	Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus	Sigma aldrich	N4642	Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose	Sigma Aldrich	G-8270	D (+) glucose
Skaker flask	Pirex	CLS4450250-6EA	Borosiicate glass
Shaker	SEV México	INO650V-7	Orbital shaker
Centrifuge table	Eppendorf	5415C	Centrifuge
Microtubes	Sigma Aldrich	Z606340	Eppendorf
Pipet tips	Axygen scientific	T-200-Y	Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette	Biohit	725130	8 channels, volume range 5-100 uL