Summary
Eenvoudige methoden beschreven voor het aantonen van de productie van cytotoxische amyloids na infectie van pulmonaire endotheel door Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Patiënten die longontsteking overleven hebben verheven sterftecijfers in de maanden na ziekenhuis kwijting. Het heeft zijn veronderstelde dat besmetting van pulmonaire weefsel tijdens longontsteking resulteert in de productie van langlevende cytotoxins die tot daaropvolgende einde orgaanfalen leiden kunnen. Wij hebben ontwikkeld in vitro testen om te testen van de hypothese dat cytotoxins worden geproduceerd tijdens de pulmonaire infectie. Geïsoleerde rat pulmonaire endotheliale cellen en de bacterie Pseudomonas aeruginosa worden gebruikt als modelsystemen, en de productie van cytoxins na infectie van de endotheliale cellen van de bacteriën wordt aangetoond door middel van cultuur van de cel gevolgd door directe kwantificatie met behulp van lactaat dehydrogenase tests en een nieuwe microscopische methode ImageJ technologie. De amyloïde aard van deze cytotoxins werd aangetoond door thioflavin T bindende analyses en door immunoblotting en immunodepletion met behulp van de A11 anti-amyloid antilichaam. Verdere analyses met behulp van immunoblotting aangetoond dat oligomere tau en Aβ werden geproduceerd en uitgebracht door endotheliale cellen na infectie door P. aeruginosa. Deze methoden moeten gemakkelijk aanpasbaar aan analyses van menselijke klinische monsters.
Introduction
Patiënten die longontsteking overleven hebben verheven sterftecijfers in de maanden na ziekenhuis geen kwijting1,2,3,,4,,5,6. In de meeste gevallen overlijden door een soort eind-orgaanfalen zoals renale, pulmonale, cardiale, of lever evenementen, evenals lijn5,6. De reden voor de verhoogde sterfte in deze populatie is nooit vastgesteld.
Longontsteking is geclassificeerd als zijnde hetzij communautaire verworven of ziekenhuizen opgelopen (nosocomiale) en agenten die longontsteking kunnen veroorzaken bevatten bacteriën, virussen, schimmels en chemicaliën. Een van de belangrijkste oorzaken van nosocomiale pneumonie is de bacterie Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa is een gram-negatieve organisme waarmee een type III secretie systeem overbrengt van verschillende effector moleculen, genoemd exoenzymes, rechtstreeks naar het cytoplasma van target cellen7,8. Tijdens de infectie van pulmonaire endotheliale cellen richten de exoenzymes verschillende intracellulaire eiwitten, met inbegrip van een endotheel vorm van de microtubulus-geassocieerde eiwit tau9,10,11,12 , leidt tot endothelial barrière verdeling resulterend in ernstige longoedeem, daalde pulmonaire functie en vaak dood.
Zoals eerder vermeld, hebben patiënten die de eerste longontsteking overleven sterftecijfers in de eerste 12 maanden na ziekenhuis kwijting verheven. Een potentiële mechanisme voor het verklaren van dit verschijnsel is dat een soort van langlevende toxine wordt gegenereerd tijdens de initiële infectie die tot slechte op lange termijn resultaat leidt. Twee opmerkingen ondersteunen deze mogelijkheid. Eerste, gekweekte pulmonaire endotheliale cellen die in eerste instantie worden behandeld met P. aeruginosa niet vermenigvuldigen voor tot een week nadat de bacteriën worden gedood door de antibiotica13. Tweede, langlevende prionen en agenten met prion kenmerken zijn aangetoond in verschillende menselijke en dierlijke ziekten, met name het zenuwstelsel14,15is gekoppeld.
Methoden voor de behandeling van de potentiële productie van langlevende cytotoxische agenten tijdens de pulmonaire infectie zijn nooit beschreven. Hier een aantal eenvoudige in vitro testen worden beschreven die kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van de cytotoxin productie en activiteit na infectie met behulp van een gemeenschappelijk longontsteking veroorzaken agent, P. aeruginosa. Deze testen moeten gemakkelijk aan te passen aan het onderzoeken van mogelijke cytotoxin inductie na infectie met behulp van andere stoffen die longontsteking veroorzaken, en het supernatant die worden gegenereerd ook moet nuttig zijn voor het onderzoeken van de effecten van de cytotoxins geheel organen of dieren. Tot slot zal de tests die worden beschreven hier waarschijnlijk worden aangepast aan het testen van dierlijke en menselijke biologische vloeistoffen voor de productie van cytotoxins tijdens longontsteking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden herzien en goedgekeurd door de institutionele en Animal Care Comité van de Universiteit van Zuid-Alabama en werden uitgevoerd volgens alle federale, staats- en lokale regelgeving. Primaire culturen van rat pulmonaire microvasculaire endotheliale cellen (PMVECs) werden verkregen uit de cel cultuur Core faciliteit bij de Universiteit van Zuid-Alabama's Center for Lung Biology. Cellen werden opgesteld op basis van de eerder beschreven procedures16.
1. generatie van cytotoxische supernatant
Opmerking: Hier, wij gebruiken twee verschillende stammen van P. aeruginosa: PA103, die een intact type III secretie systeem geschikt heeft voor het overbrengen van de exoenzymes ExoU en ExoT naar doelcellen tijdens de infectie, en ∆PcrV, die het ontbreken van een type III secretie systeem en is niet in staat zijn van overdracht van exoenzymes naar doelcellen na inoculatie.
- Strijk bacteriën op Vogel-Bonner (VB) agar platen17 en 's nachts groeien bij 37 ° C.
- Ter voorbereiding van platen, maken de volgende stockoplossing (Vogel-Bonner zouten; 10 x voorraad): 2 g MgSO4, 20 g citroenzuur (vrij zuur), 100 g K2PO4en 35 g NaH2PO4meten. DdH2O aan 1 L en autoclaaf gedurende 15 minuten met langzame uitlaat toevoegen.
- Plaats 7,5 g agar in 450 mL ddH2O en autoclaaf als hierboven.
- Na autoclaaf, plaatst u beide oplossingen in een waterbad van 50 ° C afkoelen.
- Voeg 50 mL van de 10 x VB zout stockoplossing aan de agar.
- Toevoegen van carbenicillin aan 400 µg Mo/mL (voor de stammen van P. aeruginosa wordt gebruikt) en meng goed door de kolf zwenken.
- Plaats 5 mL van de oplossing van de agar VB in individuele steriele cultuur gerechten, toestaan de agar stollen, en vervolgens opslaan bij 4 ° C tot de dag van bacteriële zaaien.
- Op de dag van bacteriële zaaien, vooraf een plaat tot 37 ° C warm en dan strijk bacteriën op het bord met een steriele lus. Plaats de plaat in een incubator 37 ° C's nachts.
- Controleer of PMVEC zuiverheid door positieve kleuring met fluorescerende Griffonia simplicifolia lectine en negatieve kleuring met fluorescerende Helix pomatia lectine (een marker voor arteriële endotheliale cellen). Aliquot cellen en bevriezing in vloeibare stikstof.
- Onderhouden van cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum voor experimenten, en groeien van cellen in een incubator van de 37 ° C met 5% CO2. Het gebruik van cellen op passages 5-15.
- Voor de opwekking van cytotoxische supernatant, plaat 2 x 106 cellen in individuele 150 cm gerechten en groeien voor 3-4 dagen totdat samenvloeiing is bereikt. Gebruik twee platen per experiment (zie hieronder).
- Voor analyse van cytotoxische supernatant, plaat 1 x 105 cellen in individuele putjes van een 6-well schotel en groeien voor vier dagen totdat samenvloeiing is bereikt.
- Om te produceren supernatant, was een van de twee 150 cm gerechten van PMVECs uit stap 1.3.1 met fosfaat gebufferde zoutoplossing, trypsinize en vervolgens de cellen tellen (wij gebruiken een geautomatiseerde cel teller en volg de fabrikant protocol; Zie Tabel van materialen). Het andere gerecht van PMVECs met Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) wassen en vervolgens besmetten met beide stam van P. aeruginosa bij een veelheid van infectie (MOI) van 20:1. Dit wordt als volgt bereikt:
- Voor P. aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 CFUs/mL. Ter voorbereiding van deze tweevoudige verdunning, aan een wegwerp cuvette van 1 mL met toevoegen van 1 mL HBSS. Schraap genoeg bacteriën off van de plaat dat in stap 1.1 was bereid tot een OD-540 van 0,25 wordt bereikt wanneer gemeten met een spectrofotometer. De volgende stap zal zorgen voor een berekening van hoeveel bacteriën nodig zullen zijn.
- Nadat het aantal PMVECs in de cultuur-schotel is vastgesteld (stap 1.4 hierboven), bepalen van het juiste aantal bacteriën worden toegevoegd aan de tweede, niet-trypsinized cultuur-schotel met de PMVECs. Bijvoorbeeld, indien wordt vastgesteld dat de cultuur schotel van PMVECs 1.3 x 107 cellen bevat, dan bereiden 1.3 x 107 cellen x 20 bacteriën/cel x 1 mL/2 x 108 CFUs = 1.3 mL bacteriën.
- Verdun de 1.3 mL van bacteriën in HBSS tot een eindvolume van 20 mL, zodat de volledige oppervlakte van een 150 cm schotel vloeistof kan worden voorzien, dan de verdunde bacteriën toevoegen aan de plaat van PMVECs.
- Incubeer de PMVECs geënt met de bacteriën bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 4-5 h, totdat gaten kunnen worden gezien in de cel enkelgelaagde vormen wanneer de plaat wordt microscopisch waargenomen (Zie Figuur 1 voor goede niveau van kloof vorming).
- Verzamelen van het supernatant en Centrifugeer gedurende 10 min bij 2.000 x g in een tafelblad centrifuge cellulaire puin te verwijderen.
Opmerking: Elk tafelblad centrifuge kunnen genereren voldoende g omzetten in pellet unlysed cellen en grote cel fragmenten kunnen worden gebruikt voor deze stap. - Giet het supernatant in een injectiespuit met een 0,2 µm filter gekoppeld aan zijn einde, vervolgens het supernatant passeren door het filter te verwijderen van bacteriën.
- Gebruik een aliquoot gedeelte van het supernatans dat steriele om te testen van de cytotoxiciteit (zie 2.1) en de rest van het supernatant bij-80 ° C voor toekomstig gebruik te bevriezen.
2. analyse van cytotoxische supernatant
- Bepaling van de cytotoxiciteit
- Groeien PMVECs in 6-well gerechten tot de samenvloeiing. Wash wells Voeg eenmaal HBSS, vervolgens 1,5 mL filter-gesteriliseerde supernatant (verzameld uit beide cellen PA103 - of ∆PcrV-geënt) aan individuele putjes. Steriele HBSS wordt als een negatieve controle aan een ander goed toevoegen.
- Plaats de plaat in de CO2 -incubator voor 21-24 h, en vervolgens waarnemen voor cel doden/cytotoxiciteit (zie volgende stap). Gebruik van supernatant die vertonen van de cytotoxiciteit voor verdere experimenten en negeren die geen cel doden vertonen.
- Kwantificatie van het doden van de cel
- Maatregel lactaat dehydrogenase (LDH) vrijlating uit dode cellen met behulp van commercieel beschikbare LDH test Kits en fabrikant aanbevolen procedures.
- Als alternatief, cel doden microscopisch ImageJ softwarematig te kwantificeren. Hiervoor opnemen van microscopische beelden en gebieden van de cultuur-schotel met intact cellen, dan kwantificeren regio's ontbreekt cellen (indicatief van celdood in een enkelgelaagde) met behulp van een aangepaste macro voor ImageJ (National Institutes of Health) (Zie aanvullende codering bestand ). Indien gewenst, voert u de stappen van de macro als volgt handmatig:
- Input beelden (RGB- of TIFF-formaat) in de macro en helderheid op 15% verzadigd pixels. Contrast-aangepast afbeeldingen dupliceren en uitvoeren van de opdracht "aftrekken achtergrond" om een contrastrijk beeld van zowel de cel als de kloof gebied binnen het gezichtsveld te krijgen.
- Aftrekken van dit beeld van de oorspronkelijke afbeelding en de resulterende afbeelding met de oorspronkelijke afbeelding met behulp van de calculator van het beeld "En"-functie te combineren. De resulterende afbeelding omzetten in zwart (hiaten) en wit (cellen) masker met de drempel-functie (minimaal 0, maximaal 5), en gebruik van de functie "binaire eroderen" verwijderen van ruis van het beeld.
- Het meten van de verhouding van zwart naar wit pixels binnen het resulterende beeld met behulp van de "gebied fractie" meting. Uitzetten en fractionele gebieden voor het tijdstip van elke behandeling wordt uitgedrukt als percentage van maximale gap omgeving.
- Berekenen van de middelen en vergelijken met one-way ANOVA met de Tukey post hoc test, met p -waarden minder dan 0,05 beschouwd als belangrijke.
- Immunoblot analyse gebruiken om de aanwezigheid van amyloid oligomere tau en Aβ in supernatant van cultuur. Immunoblot analyses met behulp van standaardprocedures10,11,12, met uitzondering van concentreren cultuur supernatant ten minste 10-fold voordat de elektroforese uit te voeren.
- Te concentreren supernatant, 1-2 mL van het supernatans dat in een centrifugeren filter eenheid waarvan membraan een cut-off molecuulgewicht van 10 kDa heeft te plaatsen. Dan, plaats de filter eenheid in een tafelblad centrifuge en centrifuge op 2.000 x g totdat de vereiste mate van concentratie is bereikt (meestal 45-60 minuten).
- Bepalen van de hoeveelheid eiwit in de geconcentreerde supernatant11 en laadt gelijke hoeveelheden van monsters in individuele putjes van de gel.
- Stormloop gels, de eiwitten overbrengen in nitrocellulose, vervolgens sonde blots met A11 anti-amyloid antilichaam, T22 anti-oligomere tau antilichaam of MOAB2 anti-Aβ antilichaam gevolgd door passende secundaire antilichamen. De vlekken met behulp van standaard Chemoluminescentie procedures te ontwikkelen.
- Gebruiken om te doen een thioflavin T-Assay, thioflavin T, fluorescentie (ThT) te kwantificeren amyloids in supernatant. Voor deze metingen, gebruik filter-gesteriliseerde supernatant.
- Bereiden een stockoplossing (50 x) van thioflavin T door schorsing van 8 mg thioflavin T (ThT) in 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Filtreer de oplossing door een 0,22 µm filter verwijderen deeltjes na mengen.
- Voor metingen, Voeg 20 µL van ThT voorraad aan 1 mL PBS in een cuvet van de spectrofotometer 1 mL. Plaats het verdunde monster af in een spectrofluorimeter.
- Het meten van de basislijn fluorescentie uitstoot met behulp van 425 nm excitatie en scannen van de uitstoot van de fluorescentie van 450-575 nm in stappen van 2 nm.
- Een time-lapse scannen met behulp van 425 nm excitatie en 482 nm emissie, met gegevens verworven elke 0,2 s voor 60 s.
- De eerste 20 s van de time-lapse scan meet fluorescentie in de lege cuvette. 20 s, de scan pauzeren en 10 µL van het supernatans dat filter-gesteriliseerde toevoegen aan de cuvette. Meng de cuvette door inversie en vervolgens plaats terug in de spectrofluorimeter.
- Hervatten van de tijd gebaseerde scan, verwerven de laatste 40 s van gegevens.
- Na voltooiing van de time-lapse scan, scannen een definitieve fluorescentie emissiespectrum met identieke instellingen, zoals wordt beschreven in 2.1.5.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een eenvoudige in vitro -assay is ontwikkeld om assay voor de aanwezigheid van cytotoxins in supernatant van cellen die zijn besmet met de bacterie P. aeruginosa. Kortom, kweekmedium van geïnfecteerde cellen 4 h na bacteriële toevoeging is verzameld, de bacteriën worden verwijderd door het filter sterilisatie van de cultuur supernatant en vervolgens het steriele supernatant wordt toegevoegd aan een nieuwe bevolking van cellen. De cellen worden vervolgens waargenomen 21-24 uur na de toevoeging van de bovendrijvende substantie en doden van de cel wordt gekwantificeerd.
Toevoeging van P. aeruginosa confluente lagen van PMVECs induceert de vorming van gaten tussen de cellen. In vivo, de vorming van de kloof leidt tot longoedeem en verminderde pulmonaire functie. In de beschreven assay, wordt kloof vorming gebruikt, zoals de tijd-punt voor screening voor cytotoxin introductie in cel cultuur supernatant en voldoende duur van incubatie met PA103 is aangegeven door de aanwezigheid van de leemtes die te vormen in de cel enkelgelaagde beginnen zoals aangegeven in Figuur 1. ΔPcrV bacteriën doen geen cel lacunes onder deze incubatieomstandigheden veroorzaken. Zodra de hiaten worden gedetecteerd, het supernatant is verzameld, filter gesteriliseerd, en vervolgens toegevoegd aan de naïeve PMVECs om te beoordelen van cytotoxische activiteit. De PMVECs in hun respectieve supernatant zijn vervolgens geplaatst in een incubator voor 21-24 h, waargenomen en gefotografeerd. Zoals afgebeeld in Figuur 2, bevatte bovendrijvende substantie verzameld uit PMVECs die was besmet met P. aeruginosa stam PA103 cytotoxins die dood van gekweekte cellen door 21 h na toevoeging van het supernatant veroorzaakte. Daarentegen werd geen celdood waargenomen in cellen behandeld met ofwel HBSS medium of met bovendrijvende substantie verzameld van de ΔPcrV-stam van Pseudomonas. Immunoblot analyse aangetoond dat amyloïde moleculen, waaronder oligomere tau en Aβ, ontstaan tijdens de infectie met de PA103-stam, hoewel geen amyloids worden gegenereerd door de stam van de ΔPcrV na inoculatie van PMVECs (Figuur 2). De rol van amyloids als de cytotoxins in deze test is bevestigd door de immunodepletion van amyloids van het supernatant vóór toevoeging aan gekweekte cellen12. Hoewel hier niet getoond, put immunodepletion van cytotoxische supernatans A11 anti-amyloid antilichaam en T22 anti-tau oligomeren antilichaam volledige benutting cytotoxische activiteit van supernatant geproduceerd na PA103 infectie (Balczon et al. 2017 12 en Balczon et al., in voorbereiding).
Een nieuwe, goedkope en eenvoudige methode voor de kwantificering van het doden van de cel is ontwikkeld. ImageJ software is al deze assay, aangepast om rechtstreekse meting van gebieden in een microscopische veld dat het gebrek aan cellen (indicatief van het doden van de cel). De betrouwbaarheid van deze methode is geverifieerd door directe vergelijking met de gevestigde methode voor het meten van cel doden, oftewel LDH vrijlating uit cellen. Zoals blijkt uit Figuur 3, kan ImageJ software worden gebruikt om te converteren van een microscopische veld met cellen naar wit en regio's die geen cellen tot zwart. Een eenvoudige verhouding van witte gebieden zwart kan vervolgens worden gebruikt voor het meten van de doden van de cel. Bij het starten met een confluente enkelgelaagde van cellen, zijn alle regio's van de microscopische veld wit. Echter door 18 h na toevoeging van supernatant met cytotoxins, kon lacunes in de enkelgelaagde worden opgespoord. Het bedrag van het gebied van de cultuur-schotel verstoken van cellen wordt verhoogd in een lineair tot 36 h na toevoeging van het supernatans dat cytotoxische. Bij het meten van LDH release, werden identieke resultaten verkregen, met LDH release eerste om 18 h na toevoeging van cytotoxische supernatant wordt ontdekt. LDH release verhoogd dan op een lineaire wijze tot maximale cel doden werd gemeten op 36 h na toevoeging van de bovendrijvende substantie. Weinig celdood werd gemeten in cellen die zijn behandeld met bovendrijvende substantie verzameld uit ΔPcrV geënt cellen (Figuur 3) of in culturen behandeld met HBSS voor 36 h.
Het bedrag van amyloid vrijgelaten uit cellen die zijn behandeld met bacteriën kan worden gekwantificeerd door het meten van ThT fluorescentie. Binding van amyloids aan ThT veroorzaakt een conformationele verschuiving in het molecuul en een toename in intensiteit van de fluorescentie. Voor deze test, thioflavin T wordt toegevoegd aan een cuvet en basislijn fluorescentie wordt gemeten. De fluorescentie-opname wordt dan gestopt terwijl een kleine hoeveelheid van het monster is toegevoegd. De cuvette is keerde terug naar de fluorimeter en de verandering is fluorescentie aflevering is opgenomen. Zoals blijkt uit Figuur 4, bovendrijvende substantie verzameld uit cellen die werden geïncubeerd met PA103 stam van P. aeruginosa bevatte amyloid zoals aangegeven door de toename van de emissie van de fluorescentie. Daarentegen ontbrak supernatant van PMVECs met ΔPcrV stam geënt amyloids, zoals aangegeven door het ontbreken van verhoogde fluorescentie.
Figuur 1. Effecten van P. aeruginosa inolculation op de PMVEC morfologie. Een confluente enkelgelaagde van PMVECs voor (A) en vier uur na de toevoeging (B) van PA103 stam van P. aeruginosa. Lacunes kunnen duidelijk worden gezien in de cel enkelgelaagde in de geïnfecteerde cellen. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Analyses van cytotoxische supernatant. Deel [I]. Representatieve beelden van de controle en de behandelde cellen. PMVECs werden behandeld voor 21 h met bovendrijvende vloeistof verkregen cellen geënt met beide PA103 bacteriën (B) of stam ΔPcrV (C). Cellen werden ook geïncubeerd voor 21 h met HBSS buffer (A). Schaal bar = 100 µm. deel [II]. Vertegenwoordiger immunoblots van supernatant verzameld vanuit ΔPcrV (A) of PA103 (B) besmet PMVECs. Blots waren gesondeerd met antilichamen tegen amyloid (A11) of oligomere tau (T22). Mr in kDa. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Kwantificatie van cel doden. (A) representatieve Microscoop velden uit verschillende tijdstippen (in h na bezinken toevoeging) in welke regio's van het veld met en gebrek aan cellen werden geconverteerd naar wit of zwart, respectievelijk ImageJ softwarematig. Dezelfde fase contrast afbeelding voordat de conversie wordt ook weergegeven. Bar = 100 µm. (B) vergelijking van kwantificatie van cel doden met behulp van standaard LDH release assay en de ImageJ assay. N = 4, **p < 0,05, ***p < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Vertegenwoordiger ThT fluorescentie assay gegevens. Lege cuvettes met ThT waren enthousiast bij 425 nm en vervolgens emissie fluorescentie werd gemeten op 482 nm. Achtergrond fluorescentie werd verzameld voor 20 s, waarna supernatant van beide PA103 - of ΔPcrV-geïnoculeerd PMVECs toevoegde aan de cuvettes. Fluorescentie aflevering werd vervolgens opgenomen voor 40 sec.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier, zijn eenvoudig in vitro methoden beschreven waarmee de demonstratie van de generatie van cytotoxische amyloids tijdens de infectie met een longontsteking veroorzaken organisme. Deze methoden omvatten een cel cultuur cytotoxiciteit assay, immunoblotting, kwantificatie van cel doden met behulp van een nieuwe microscopische methode en ThT bindend. Analyses van de cytotoxische agenten hebben aangetoond dat ze amyloid in de natuur (Figuur 2 en Figuur 4) en kenmerken van een prion-12 vertonen. Het genereren van cytotoxische prion moleculen tijdens longontsteking biedt een mogelijke verklaring voor de verhoogde sterftecijfers waargenomen in longontsteking overlevenden na hun ziekenhuis kwijting. Experimenten aan de gang zijn het testen van deze mogelijkheid.
De belangrijkste gebeurtenis voor alle beschreven studies is de generatie van het supernatans dat cytotoxische en twee belangrijke variabelen moeten worden overwogen. Voor het eerst, in de geschetste experimenten rat PMVECs werden gebruikt voor zowel de infectie stap en voor de bepaling van de cytotoxiciteit. Of andere celtypes kunnen worden gebruikt voor de productie van cytotoxins niet is onderzocht in detail, en het is mogelijk dat andere cellen mogelijk cytotoxisch supernatant na behandeling met verschillende stammen van P. aeruginosagenereren. Zoals aangetoond, de cytotoxins zijn van amyloid in aard en omvatten oligomere tau en Aβ. Het is mogelijk dat het redelijk te verwachten dat andere celtypes die uitdrukking geven aan tau en/of beta-amyloïde eiwitten kunnen worden opgewekt om te genereren van cytotoxins na de bacteriële inoculatie, hoewel deze mogelijkheid blijft om te worden getest. De geschetste procedures kunnen worden gebruikt voor de behandeling of andere celtypes kunnen worden opgewekt om te produceren van cytotoxische amyloids na verschillende beledigingen.
De tweede belangrijke variabele in de generatie van de cytotoxische supernatant is de duur van de behandeling met bacteriën. Het is essentieel dat de incubatie van de PMVECs kunnen tot gaten kunnen worden gezien in de enkelgelaagde vooruitgang. De identificatie van leemtes in de cel enkelgelaagde is een indicatie exoenzymes door de Pseudomonas bacteriën zijn ingespoten in het cytoplasma van de cel host en dat de exoenzymes actief zijn, wat resulteert in de intrekking van celranden (Figuur 1). Onze ervaring is dat het tijdstip van de intrekking van celranden een betrouwbare indicator van cytotoxin introductie in het supernatant is. Het is verleidelijk om te speculeren dat de twee gebeurtenissen zijn gerelateerd als een van de cytotoxische amyloids wordt vrijgegeven oligomere tau is en verstoring van tau activiteit resulteert in microtubulus-depolymerization die tot de cel vorm wijzigingen bijdraagt. In experimenten waar de behandelingen zijn minder dan de hoeveelheid tijd die nodig is voor het opwekken van de vorming van de kloof, is weinig volwassen cytotoxische amyloid ontdekt.
De bepaling van de cytotoxiciteit wordt beschreven in dit manuscript is eenvoudig en betrouwbaar. Dood van de cel kan worden gemakkelijk waargenomen door microscopisch onderzoek en gekwantificeerd rechtstreeks vanuit opgenomen microscopische beelden. De methoden die hier worden beschreven zijn uitsluitend voor de beoordeling van de cytotoxin productie na infectie van rat pulmonaire endotheliale cellen met P. aeruginosagebruikt. Het lijkt waarschijnlijk dat de procedures gemakkelijk aangepast om te beoordelen worden konden of cytotoxische amyloids worden geproduceerd na infectie met andere longontsteking veroorzaakt door agenten, met inbegrip van zowel nosocomiale-geassocieerde bacteriën en bacteriën en virussen die verantwoordelijk zijn voor Gemeenschap-verworven soorten longontsteking. De gerapporteerde procedures zijn bovendien alleen gebruikt om de onderzoeken van cytotoxische amyloïde genereren tijdens infectie van gekweekte cellen. Cultuur van de cel is een kunstmatige systeem, en de hier geschetste waarschijnlijk procedures kunnen worden aangepast aan het beoordelen van het genereren van cytotoxins tijdens de pulmonaire infectie van diermodellen zowel menselijke patiënten. Verzameling van biologische vloeistoffen, zoals bronchoalveolar lavage, vanaf besmette dieren of patiënten kan worden gebruikt in de zelfde types van testen hier gemeld om te beoordelen of cytotoxische amyloids worden gegenereerd tijdens de infectie processen in vivo. Natuurlijk, de totale duur van incubatie met bacteriën wellicht heel anders wanneer enten in dieren en bronchoalveolar lavage zou moeten worden verzameld op meerdere tijdstip om te bepalen van de uiteindelijke duur van de behandeling.
Immunoblot analyses hebben aangetoond dat amyloids aanwezig in het supernatant zijn, met inbegrip van oligomere tau en Aβ (Figuur 3). Hoewel de immunoblot procedures standaard zijn, is er een belangrijke stap die moet worden uitgevoerd alvorens aan te vangen immunoblot analyses. Specifiek, is het essentieel dat het supernatant geconcentreerde ten minste tien keer vóór immunoblotting zoals de hoeveelheid amyloid in het VN-geconcentreerde supernatant lager dan de limiet van detectie door immunoblot analyse is. Zoals hier gemeld, centrifugeren gebruik van buizen voorzien van een filter is de methode routinematig gebruikt voor deze stap van de concentratie, maar lijkt het redelijk dat andere methoden, zoals TCA neerslag, zou net zo nuttig voor deze stap.
De kwantificatie van cel doden met behulp van afbeeldingen vertegenwoordigt een belangrijke stap vooruit. Momenteel vertrouwen beschikbare procedures voor het kwantificeren van de celdood op de aankoop van vrij dure kits waarmee meting van LDH vrijlating uit dode cellen. De hier beschreven test omvat geen kosten zoals ImageJ programma's gratis zijn te downloaden vanaf de website van NIH. De eenvoudige aanpassing van ImageJ programma's kunt vrij nauwkeurige meting van het doden van de cel. Het is echter de moeite waard erop te wijzen dat een aantal kleine artefacten zijn opgetreden tijdens de uitvoering van het protocol van het overzicht. Het grote probleem is dat de fragmenten van de cel, zoals gebieden van focal contact, geassocieerd met de cultuur schotel als cellen sterven kunnen blijven. Deze overblijvende cel fragmenten kunnen worden gedetecteerd door de camera en geeft een kunstmatige indicatie die cellen op de schotel blijven. Het is zo zeldzaam dat een waarde van 100% cel doden wordt verkregen met behulp van deze procedure.
Een zwakte van de gerapporteerde assay-systeem is dat de amyloids van de cytotoxin bij de bereiding nooit volledig zijn gedefinieerd. Kwantificatie is zo moeilijk. ELISA-tests kunnen worden gebruikt om totale niveaus van verschillende amyloids, zonder het verstrekken van gedetailleerde informatie over de afzonderlijke soorten in elk preparaat. Tot nauwkeuriger testen, zoals massa-spec of in vitro gesynthetiseerd amyloïde oligomeren, kan worden ontwikkeld, het beste dat men op dit moment doen kan is het begin van elk experiment met hetzelfde aantal cellen, incubeer voor dezelfde duur, en controleer cytotoxiciteit optreedt op dezelfde tarieven als vorige preparaten die zijn gebruikt. Variatie van een van de gevestigde normen introduceert extra onzekerheid.
Kortom, zijn eenvoudig in vitro methoden beschreven voor het aantonen van de productie van giftige amyloid moleculen door pulmonaire endotheliale cellen na infectie met een agent longontsteking veroorzaken. De tests zijn betrouwbaar en waarschijnlijk kunnen worden aangepast voor andere organismen en voor gebruik met behulp van biologische vloeistoffen afkomstig van besmette dieren en menselijke patiënten. Deze methoden zijn nuttig voor studies die onderzoeken de gevolgen van longontsteking op de lange termijn en voor de vaststelling van de mechanismen die leiden tot einde-orgaanfalen bij patiënten na ziekenhuis kwijting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen verslag.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd in delen door NIH grants HL66299 Rd, RB en SL, HL60024 naar TS, en HL136869 op MF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
