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Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa द्वारा फुफ्फुसीय Endothelial कोशिकाओं के संक्रमण के बाद साइटोटोक्सिक Amyloids का पता लगाने के लिए तरीके

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/57447
Automatic Translation
1,4, 2,4, 3,4, 2,4
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of South Alabama, 2Department of Physiology and Cell Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 4Center for Lung Biology, University of South Alabama

Summary

सरल तरीके Pseudomonas aeruginosaद्वारा फुफ्फुसीय endothelium के संक्रमण के बाद साइटोटोक्सिक amyloids के उत्पादन का प्रदर्शन करने के लिए वर्णित हैं ।

Abstract

रोगियों जो निमोनिया बच अस्पताल के निर्वहन के बाद के महीनों में मौत की दर को बुलंद किया है । यह कल्पना की गई है कि निमोनिया के दौरान फेफड़े के ऊतकों के संक्रमण के उत्पादन में लंबे समय तक रहने वाले cytotoxins कि बाद के अंत अंग विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हम इन विट्रो परख में विकसित किया है परिकल्पना है कि cytotoxins फुफ्फुसीय संक्रमण के दौरान उत्पादित कर रहे है परीक्षण । पृथक चूहा फेफड़े के endothelial कोशिकाओं और जीवाणु Pseudomonas aeruginosa मॉडल सिस्टम के रूप में उपयोग किया जाता है, और cytoxins कोशिकाओं के जीवाणुओं द्वारा निंनलिखित संक्रमण के उत्पादन के बाद सेल संस्कृति का उपयोग करके प्रदर्शित होता है प्रत्यक्ष quantitation का उपयोग कर स्तनपान डिहाइड्रोजनेज परख और एक उपंयास सूक्ष्म ImageJ प्रौद्योगिकी का उपयोग विधि । इन cytotoxins के amyloid स्वभाव को thioflavin टी बाइंडिंग परख कर और immunoblotting और immunodepletion का प्रयोग करके A11 विरोधी amyloid एंटीबॉडी द्वारा प्रदर्शित किया गया. इसके अलावा विश्लेषण का उपयोग immunoblotting का प्रदर्शन किया है कि oligomeric ताऊ और Aβ का उत्पादन किया गया और endothelial कोशिकाओं द्वारा aeruginosaद्वारा संक्रमण के बाद जारी । इन तरीकों मानव नैदानिक नमूनों का विश्लेषण करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय होना चाहिए ।

Introduction

रोगियों को जो निमोनिया बच अस्पताल निर्वहन1,2,3,4,5,6के बाद के महीनों में मौत की दर बुलंद है । ज्यादातर मामलों में, मृत्यु गुर्दे, फेफड़े, हृदय, या जिगर की घटनाओं, साथ ही स्ट्रोक5,6सहित अंत अंग विफलता के कुछ प्रकार से होता है । इस रोगी की आबादी में ऊंचा मृत्यु दर का कारण कभी नहीं स्थापित किया गया है ।

निमोनिया या तो समुदाय अधिग्रहीत किया जा रहा है या अस्पताल-अधिग्रहीत (nosocomial) के रूप में वर्गीकृत है, और निमोनिया पैदा कर सकता है एजेंटों बैक्टीरिया, वायरस, कवक, और रसायनों शामिल हैं । nosocomial निमोनिया के प्रमुख कारणों में से एक जीवाणु Pseudomonas aeruginosaहै । P. aeruginosa एक ग्राम-नकारात्मक जीव है जो विभिन्न प्रभाव वाले अणुओं को हस्तांतरित करने के लिए एक प्रकार III स्राव प्रणाली का उपयोग करता है, exoenzymes के लिए, सीधे लक्ष्य कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य करने के लिए7,8. फुफ्फुसीय endothelial कोशिकाओं के संक्रमण के दौरान, exoenzymes लक्ष्य विभिन्न intracellular प्रोटीन, microtubule के एक endothelial फार्म सहित-जुड़े प्रोटीन ताऊ9,10,11,12 , endothelial बाधा टूटने के लिए अग्रणी गंभीर फुफ्फुसीय शोफ में जिसके परिणामस्वरूप, फेफड़े के कार्य में कमी आई है और, अक्सर, मौत ।

जैसा कि पहले कहा, रोगियों जो प्रारंभिक निमोनिया बच अस्पताल के निर्वहन के बाद पहले 12 महीनों में मौत की दर ऊंचा कर दिया है । इस घटना को समझाने के लिए एक संभावित तंत्र है कि लंबे समय तक रहने वाले विष के कुछ प्रकार के प्रारंभिक संक्रमण है कि गरीब दीर्घकालिक परिणाम की ओर जाता है के दौरान उत्पन्न होता है. दो अवलोकन इस संभावना का समर्थन करते हैं । पहले, aeruginosa के साथ शुरू में इलाज कर रहे है कि कल्चरल पल्मोनरी endothelial कोशिकाओं के लिए पैदा करना करने के लिए एक सप्ताह के बाद असफल बैक्टीरिया13एंटीबायोटिक दवाओं द्वारा मारे गए हैं । दूसरा, लंबे समय तक रहते थे prions और prion विशेषताओं के साथ एजेंटों विभिन्न मानव और पशु रोगों में प्रदर्शन किया गया है, विशेष रूप से तंत्रिका तंत्र के साथ जुड़े रोगों14,15.

फेफड़े के संक्रमण के दौरान लंबे समय तक रहने वाले साइटोटोक्सिक एजेंटों के संभावित उत्पादन की जांच के लिए तरीके कभी नहीं बताया गया है । यहां सरल की एक श्रृंखला इन विट्रो परख में उल्लिखित है कि cytotoxin उत्पादन और गतिविधि के बाद एक आम एजेंट के कारण निमोनिया का उपयोग कर संक्रमण की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, पी aeruginosa। इन परख आसानी से संभव cytotoxin प्रेरण अंय एजेंटों का उपयोग कर संक्रमण के बाद की जांच करने के लिए अनुकूलनीय होना चाहिए कि कारण निमोनिया, और supernatants कि उत्पंन कर रहे है भी cytotoxins के प्रभाव की जांच के लिए उपयोगी होना चाहिए पूरे में अंगों या जानवरों । अंत में, परख है कि यहां उल्लिखित है सबसे अधिक संभावना निमोनिया के दौरान cytotoxins के उत्पादन के लिए पशु और मानव जैविक तरल पदार्थ का परीक्षण करने के लिए अनुकूल हो जाएगा ।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की और संस्थागत और दक्षिण अलबामा विश्वविद्यालय के पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और सभी संघीय, राज्य, और स्थानीय नियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया । चूहे फुफ्फुसीय microvascular endothelial कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृतियों (PMVECs) फेफड़ों जीवविज्ञान के लिए दक्षिण अलबामा के केंद्र के विश्वविद्यालय में सेल संस्कृति कोर सुविधा से प्राप्त किया गया । कक्ष पहले वर्णित कार्यविधियों16का उपयोग कर तैयार किए गए थे ।

1. साइटोटोक्सिक Supernatants की जनरेशन

नोट: यहां, हम पी aeruginosaके दो अलग उपभेदों का उपयोग करें: PA103, जो एक बरकरार प्रकार iii स्राव exoenzymes ExoU और ExoT हस्तांतरण के संक्रमण के दौरान कोशिकाओं को लक्षित करने में सक्षम प्रणाली है, और ∆ PcrV है, जो एक प्रकार iii स्राव प्रणाली का अभाव है और टीका निंन लक्ष्य कक्षों में exoenzymes स्थानांतरित करने में असमर्थ ।

  1. Vogel पर लकीर जीवाणु-Bonner (VB)17 प्लेटों और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने आगर ।
    1. प्लेट तैयार करने के लिए, निम्न स्टॉक समाधान करें (Vogel-Bonner साल्ट; 10x स्टॉक): उपाय 2 जी MgSO4, 20 ग्राम साइट्रिक एसिड (मुक्त एसिड), १०० g K2po4, और ३५ g णः2po4. धीमी निकास के साथ 15 मिनट के लिए ddH2ओ 1 एल और आटोक्लेव जोड़ें ।
    2. जगह ७.५ ग्राम आगर में ४५० एमएल ddH2ओ और आटोक्लेव में ऊपर के रूप में ।
    3. autoclaving के बाद, एक ५० डिग्री सेल्सियस पानी में दोनों समाधान जगह शांत करने के लिए स्नान ।
    4. आगर में 10x VB स्टॉक नमक समाधान के ५० मिलीलीटर जोड़ें ।
    5. carbenicillin जोड़ने के लिए ४०० µ g/mL ( P. aeruginosa के उपभेदों के लिए) का उपयोग किया जा रहा है और कुप्पी के भंवर से अच्छी तरह मिलाएं ।
    6. व्यक्तिगत बाँझ संस्कृति व्यंजन में VB आगर समाधान के 5 मिलीलीटर प्लेस, आगर जमना करने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर बैक्टीरियल बोने के दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    7. बैक्टीरियल बोने के दिन, पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए एक थाली गर्म और फिर एक बाँझ पाश का उपयोग कर प्लेट पर लकीर बैक्टीरिया. एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन रात भर में थाली प्लेस ।
  2. PMVEC शुद्धता फ्लोरोसेंट Griffonia simplicifolia लेक्टिन के साथ सकारात्मक दाग और फ्लोरोसेंट कुण्डल pomatia लेक्टिन (धमनी endothelial कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) के साथ नकारात्मक धुंधला द्वारा सत्यापित करें । Aliquot कोशिकाओं और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज ।
  3. प्रयोगों के लिए, Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखने (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक है, और 5% सह2युक्त एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में कोशिकाओं को विकसित. 5-15 मार्ग पर कोशिकाओं का उपयोग करें ।
    1. साइटोटोक्सिक supernatants, प्लेट 2 x 106 व्यक्तिगत १५० cm व्यंजन में कोशिकाओं के उत्पादन के लिए और 3-4 दिनों के लिए बढ़ने तक संगम हासिल की है । प्रति प्रयोग दो प्लेटों का उपयोग करें (नीचे देखें).
    2. साइटोटोक्सिक supernatants के विश्लेषण के लिए, प्लेट 1 x 105 कोशिकाओं एक 6-अच्छी तरह से पकवान के व्यक्तिगत कुओं में और चार दिनों के लिए बढ़ने तक संगम हासिल की है ।
  4. supernatant का उत्पादन करने के लिए, एक PMVECs के २ १५० cm व्यंजन को फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा, trypsinize के साथ 1.3.1 से धो लें, और फिर कोशिकाओं की गिनती करें (हम एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करते हैं और निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हैं; सामग्री की तालिकादेखें). है हांक संतुलित नमक समाधान के साथ PMVECs के अंय पकवान धो (HBSS) और फिर 20:1 के संक्रमण (MOI) की बहुलता पर पी. aeruginosa के तनाव से संक्रमित । इस प्रकार के रूप में प्राप्त की है:
    1. For P. aeruginosa, OD५४० ०.२५ = 2 x 108 CFUs/ इस कमजोरता को तैयार करने के लिए 1 मिलीलीटर HBSS को 1 एमएल डिस्पोजेबल cuvette में डालें । पर्याप्त बैक्टीरिया बंद प्लेट कि १.१ चरण में तैयार किया गया था जब तक कि एक spectrophotometer का उपयोग कर मापा ०.२५ के एक आयुध डिपो५४० हासिल की है । अगला कदम कितना बैक्टीरिया की जरूरत होगी की गणना प्रदान करेगा ।
    2. एक बार कल्चरल डिश में PMVECs की संख्या निर्धारित होती है (स्टेप १.४ से ऊपर), बैक्टीरिया की उचित संख्या का निर्धारण दूसरी, नॉन-trypsinized कल्चरल डिश PMVECs से युक्त करने के लिए जोड़ा जा सकता है. उदाहरण के लिए, यदि यह निर्धारित किया जाता है कि PMVECs के कल्चर डिश में १.३ x 107 कक्ष हैं, तो १.३ x 107 कोशिकाओं x 20 बैक्टीरिया/सेल एक्स 1 एमएल/2 x 108 CFUs = १.३ मिलीलीटर बैक्टीरिया तैयार करें ।
    3. 20 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए HBSS में बैक्टीरिया की १.३ मिलीलीटर पतला है, ताकि एक १५० सेमी डिश की पूरी सतह तरल पदार्थ के साथ कवर किया जा सकता है, तो PMVECs की थाली में पतला बैक्टीरिया जोड़ें ।
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस में बैक्टीरिया के साथ PMVECs inoculated एक 5% CO2 मशीन में 4-5 घंटे के लिए मशीन, जब तक अंतराल सेल monolayer में बनाने देखा जा सकता है जब प्लेट microscopically मनाया जाता है (अंतर गठन के उचित स्तर के लिए 1 चित्रा देखें) ।
    5. supernatant लीजिए, तो एक तालिका में २,००० एक्स जी में 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक को सेलुलर मलबे को हटाने के केंद्रापसारक ।
      नोट: किसी भी तालिका के शीर्ष केंद्रापसारक गोली unlysed कोशिकाओं और बड़े सेल टुकड़े करने के लिए पर्याप्त जी बल पैदा करने में सक्षम इस कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    6. एक सिरिंज है कि एक ०.२ µm अपने अंत से जुड़ी फिल्टर है में supernatant डालो, तो फिल्टर के माध्यम से supernatant पारित करने के लिए बैक्टीरिया को दूर ।
    7. cytotoxicity का परीक्षण करने के लिए बाँझ supernatant के एक aliquot का उपयोग करें (२.१ देखें) और भविष्य के उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर supernatant के बाकी फ्रीज.

2. साइटोटोक्सिक Supernatants का विश्लेषण

  1. Cytotoxicity परख
    1. संगम तक ६-अच्छी तरह से व्यंजन में PMVECs बढ़ाएँ. HBSS के साथ एक बार धो कुओं, तो फ़िल्टर-निष्फल supernatant के १.५ मिलीलीटर जोड़ें (या तो PA103-या ∆ PcrV-inoculated कोशिकाओं से एकत्र) व्यक्तिगत कुओं के लिए । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक और अच्छी तरह से बाँझ HBSS जोड़ें.
    2. 21-24 ज के लिए सह2 मशीन में थाली प्लेस, तो सेल की हत्या के लिए निरीक्षण/cytotoxicity (अगला कदम देखें) । supernatants का प्रयोग करें कि आगे प्रयोग के लिए cytotoxicity प्रदर्शन, और उन है कि सेल की हत्या नहीं दिखा त्यागें ।
    3. सेल के Quantitation की हत्या
      1. मापने स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (LDH) मृत कोशिकाओं से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध LDH परख किट और निर्माता की सिफारिश की प्रक्रियाओं का उपयोग कर रिलीज ।
      2. वैकल्पिक रूप से, यों तो कोशिका हत्या microscopically ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । इस के लिए, रिकॉर्ड सूक्ष्म छवियों और संस्कृति बरकरार कोशिकाओं युक्त पकवान के क्षेत्रों, तो कोशिकाओं की कमी क्षेत्रों (एक monolayer में कोशिका मृत्यु का संकेत) का उपयोग कर एक कस्टम ImageJ (स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान) स्थूल ( अनुपूरक कोडिंग फ़ाइल देखें ). यदि वांछित, मैक्रो चरणों को मैन्युअल रूप से निम्नानुसार ले:
        1. इनपुट छवियां (RGB या Tiff स्वरूप) मैक्रो में और 15% संतृप्त पिक्सेल के विपरीत समायोजित करें । डुप्लिकेट कंट्रास्ट-छवियों समायोजित और दृश्य के क्षेत्र के भीतर दोनों सेल और अंतर क्षेत्र के एक उच्च विपरीत छवि प्राप्त करने के लिए "पृष्ठभूमि घटाना" आदेश प्रदर्शन ।
        2. मूल छवि से इस छवि घटाना और छवि कैलकुलेटर का उपयोग कर मूल छवि के साथ परिणामी छवि गठबंधन "और" समारोह । परिणामी छवि को थ्रेशोल्ड फ़ंक्शन (न्यूनतम 0, अधिकतम 5) के साथ काले (अंतराल) और श्वेत (कक्ष) मास्क में कनवर्ट करें, और छवि से शोर हटाने के लिए "बाइनरी घिस" फ़ंक्शन का उपयोग करें.
        3. "क्षेत्र भिन्न" माप का उपयोग करते हुए परिणामी छवि के भीतर काले सफेद पिक्सेल के अनुपात को मापने. साजिश और अधिकतम अंतराल क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में प्रत्येक उपचार के समय बिंदु के लिए आंशिक क्षेत्रों एक्सप्रेस ।
        4. गणना का मतलब है और एक तरह से ANOVA के साथ Tukey की पोस्ट हॉक टेस्ट के साथ, पी मूल्यों से कम ०.०५ महत्वपूर्ण माना जाता की तुलना करें ।
    4. संस्कृति supernatants में amyloid, oligomeric तौ, और Aβ की उपस्थिति स्थापित करने के लिए immunoblot विश्लेषण का प्रयोग करें । मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए immunoblot विश्लेषण निष्पादित करें10,11,12, ध्यान केंद्रित संस्कृति को छोड़कर ट्रो करने के लिए पहले से कम 10 गुना supernatants.
      1. supernatant ध्यान केंद्रित करने के लिए, supernatant के एक केंद्रापसारक फिल्टर इकाई जिसका झिल्ली एक आणविक वजन में कटौती 10 केडीए के बंद है में 1-2 मिलीलीटर जगह है । फिर, एक तालिका के शीर्ष में फिल्टर इकाई जगह और २,००० एक्स जी पर केंद्रापसारक जब तक एकाग्रता की आवश्यकता की डिग्री हासिल की है (आमतौर पर ४५-६० मिनट) ।
      2. केंद्रित supernatant11 में प्रोटीन की मात्रा का निर्धारण और जेल के व्यक्तिगत कुओं में नमूने के बराबर मात्रा में लोड ।
      3. जैल भागो, nitrocellulose करने के लिए प्रोटीन हस्तांतरण, तो या तो A11 विरोधी amyloid एंटीबॉडी, T22 विरोधी oligomeric ताऊ एंटीबॉडी, या MOAB2 विरोधी Aβ एंटीबॉडी के साथ दाग जांच उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया । मानक chemiluminescence प्रक्रियाओं का उपयोग कर दाग को विकसित करना ।
    5. एक thioflavin टी परख करने के लिए, amyloids में supernatants यों को thioflavin टी प्रतिदीप्ति (थट) का प्रयोग करें । इन मापन के लिए, फ़िल्टर-निष्फल supernatants का उपयोग करें ।
      1. 8 मिलीग्राम thioflavin टी (थट) 10 मिलीलीटर फास्फेट में निलंबित द्वारा thioflavin टी के एक शेयर समाधान (50x) तैयार (पंजाब) । मिश्रण के बाद, कण को हटाने के लिए एक ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से समाधान फिल्टर ।
      2. माप के लिए, एक 1 मिलीलीटर spectrophotometer cuvette में पंजाब के 1 मिलीलीटर के लिए थट शेयर के 20 µ एल जोड़ें । पतला नमूना एक spectrofluorimeter में रखें ।
      3. ४२५ एनएम उत्तेजना का उपयोग कर आधारभूत प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को मापने और 2 एनएम वेतन वृद्धि में 450-575 एनएम से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्कैनिंग ।
      4. ४२५ एनएम उत्तेजना और ४८२ एनएम उत्सर्जन का उपयोग कर एक समय चूक स्कैन करें, डेटा के साथ ६० s के लिए हर ०.२ एस का अधिग्रहण किया ।
      5. समय के प्रारंभिक 20 एस चूक स्कैन के उपाय प्रतिदीप्ति रिक्त cuvette में । 20 s पर, स्कैन को रोकें और फ़िल्टर के 10 µ l को जोड़ें-निष्फल supernatant को cuvette. cuvette को उलटा करके मिक्स करें और फिर वापस spectrofluorimeter में लगाएं ।
      6. समय-आधारित स्कैन, डेटा के अंतिम ४० s प्राप्त करना फिर से शुरू करें ।
      7. समय चूक स्कैन के पूरा होने पर, एक अंतिम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम समान सेटिंग्स का उपयोग कर स्कैन, के रूप में 2.1.5.3 में विस्तृत प्रदर्शन करते हैं ।

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Representative Results

एक सरल इन विट्रो परख जीवाणु पी aeruginosaसे संक्रमित कोशिकाओं के supernatants में cytotoxins की उपस्थिति के लिए परख करने के लिए विकसित किया गया है । मूलतः, संक्रमित कोशिकाओं से संस्कृति मध्यम 4 एच एकत्र की है बैक्टीरियल इसके अलावा, बैक्टीरिया की संस्कृति supernatant की नसबंदी फिल्टर द्वारा हटा दिया जाता है, और फिर बाँझ supernatant कोशिकाओं की एक नई आबादी के लिए जोड़ा जाता है. कोशिकाओं को फिर मनाया जाता है 21-24 supernatant और सेल हत्या के अलावा के बाद एच quantified है ।

aeruginosa के अलावा PMVECs की धाराप्रवाह परतों के लिए कोशिकाओं के बीच अंतराल के गठन लाती है । vivo में, अंतर गठन फुफ्फुसीय शोफ की ओर जाता है और फेफड़े के कार्य में कमी आई । वर्णित परख में, अंतर गठन सेल संस्कृति supernatants में cytotoxin रिहाई के लिए स्क्रीनिंग के लिए समय बिंदु के रूप में प्रयोग किया जाता है और PA103 के साथ मशीन की पर्याप्त अवधि अंतराल की उपस्थिति है कि सेल monolayer में रूप में दिखाया के रूप में शुरू से संकेत दिया है चित्र 1. ΔPcrV बैक्टीरिया इन मशीन की स्थिति के तहत कोशिका अंतराल के लिए प्रेरित नहीं करते । एक बार अंतराल का पता चला रहे हैं, supernatant एकत्र की है, फिल्टर निष्फल, और फिर साइटोटोक्सिक गतिविधि का आकलन करने के लिए भोली PMVECs को जोड़ा । उनके संबंधित supernatants में PMVECs तो 21-24 घंटे के लिए एक मशीन में रखा जाता है, और फिर मनाया और फोटो खिंचवाने । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, supernatant PMVECs है कि पी aeruginosa तनाव PA103 से संक्रमित किया गया था cytotoxins निहित है कि 21 से supernatant के अलावा के बाद संस्कृति कोशिकाओं की मौत प्रेरित शामिल है । इसके विपरीत, कोई सेल मौत या तो HBSS माध्यम से या Pseudomonas के ΔPcrV तनाव से एकत्र supernatant के साथ इलाज नियंत्रण कोशिकाओं में मनाया गया । Immunoblot विश्लेषण से यह प्रदर्शित होता है कि oligomeric तौ और Aβ सहित amyloid अणु, PA103 तनाव के साथ संक्रमण के दौरान उत्पन्न होते हैं, जबकि कोई amyloids ΔPcrV (चित्रा २) के निम्नलिखित टीका PMVECs तनाव उत्पन्न कर रहे हैं । इस परख में cytotoxins के रूप में amyloids की भूमिका की पुष्टि की गई है immunodepletion amyloids से पहले supernatant से संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के अलावा12। हालांकि यहां नहीं दिखाया गया है, immunodepletion साइटोटोक्सिक supernatant का उपयोग A11 विरोधी amyloid एंटीबॉडी और T22 विरोधी ताऊ oligomer एंटीबॉडी पूरी तरह से गिरेगा साइटोटोक्सिक गतिविधि से supernatants उत्पादन निम्नलिखित PA103 संक्रमण (Balczon एट अल. २०१७ 12 और Balczon एट अल., तैयारी में) ।

एक उपंयास, सस्ती, और सेल हत्या के ठहराव की सरल विधि विकसित किया गया है । इस परख के लिए, ImageJ सॉफ्टवेयर के लिए एक सूक्ष्म क्षेत्र में क्षेत्रों के प्रत्यक्ष माप की अनुमति है कि कमी कोशिकाओं (कोशिका हत्या का संकेत) अनुकूलित किया गया है । इस विधि की विश्वसनीयता सेल हत्या, जो कोशिकाओं से LDH जारी है मापने की अच्छी तरह से स्थापित विधि से प्रत्यक्ष तुलना द्वारा सत्यापित किया गया है । के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, ImageJ सॉफ्टवेयर एक सूक्ष्म क्षेत्र है कि सफेद और क्षेत्रों है कि कोशिकाओं को काले रंग की कमी के लिए कोशिकाओं को शामिल करने के क्षेत्रों में परिवर्तित किया जा सकता है । फिर, काले करने के लिए सफेद क्षेत्रों के एक साधारण अनुपात कोशिका हत्या को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जब कोशिकाओं की एक धाराप्रवाह monolayer के साथ शुरू, सूक्ष्म क्षेत्र के सभी क्षेत्रों सफेद होते हैं । हालांकि, द्वारा 18 ज cytotoxins युक्त supernatants के अलावा के बाद, monolayer में अंतराल का पता लगाया जा सकता है । संस्कृति के क्षेत्र की मात्रा कोशिकाओं से रहित पकवान तो एक रैखिक तरीके से ३६ एच पोस्ट साइटोटोक्सिक supernatant के अलावा जब तक वृद्धि हुई । जब LDH रिलीज को मापने, समान परिणाम LDH रिलीज के साथ प्राप्त किए गए पहली साइटोटोक्सिक supernatant के अलावा के बाद 18 ज में पाया जा रहा है । LDH रिहाई तो एक रैखिक तरीके से अधिक से अधिक सेल की हत्या supernatant के अलावा के बाद ३६ ज पर मापा गया था में वृद्धि हुई । लिटिल सेल मौत ΔPcrV inoculated कोशिकाओं से एकत्र supernatant के साथ इलाज किया कोशिकाओं में मापा गया था (चित्रा 3) या ३६ एच के लिए HBSS के साथ इलाज संस्कृतियों में.

जीवाणुओं से उपचारित कोशिकाओं से जारी amyloid की मात्रा को मापने के द्वारा quantified थट प्रतिदीप्ति जा सकता है. थट करने के लिए amyloids के बंधन अणु में एक संरचना बदलाव और प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि का कारण बनता है । इस परख के लिए, thioflavin टी एक cuvette और आधारभूत प्रतिदीप्ति के लिए जोड़ा जाता है मापा जाता है । प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग फिर बंद कर दिया है, जबकि एक छोटा सा aliquot नमूना जोड़ा जाता है । cuvette तो fluorimeter को लौटा दिया जाता है और परिवर्तन प्रतिदीप्ति उत्सर्जन दर्ज किया जाता है. के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, supernatant कोशिकाओं है कि पी aeruginosa के PA103 तनाव के साथ मशीन थे से एकत्र के रूप में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में वृद्धि द्वारा संकेत दिया amyloid निहित । इसके विपरीत, ΔPcrV तनाव के साथ PMVECs inoculated से supernatant amyloids कमी आई, के रूप में वृद्धि की प्रतिदीप्ति की अनुपस्थिति से संकेत दिया ।

Figure 1
चित्र 1. PMVEC आकृति पर P. aeruginosa inolculation का प्रभाव । PMVECs के एक धाराप्रवाह monolayer से पहले (क) और चार घंटे के बाद (ख) पी aeruginosaके PA103 तनाव के । अंतराल स्पष्ट रूप से संक्रमित कोशिकाओं में कोशिका monolayer में देखा जा सकता है । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2. िरा के साइटोटोक्सिक supernatants । भाग [I] । नियंत्रण और उपचारित कक्षों की प्रतिनिधि छवियां । PMVECs के साथ 21 एच के लिए इलाज किया गया supernatant कोशिकाओं से inoculated या तो PA103 बैक्टीरिया (ख) या तनाव ΔPcrV (सी)के साथ प्राप्त की । नियंत्रण कोशिकाओं को भी 21 HBSS बफर (एक)के साथ एच के लिए मशीन थे । स्केल बार = १०० µm. Part [II]. या तो ΔPcrV (क) या PA103 (ख) संक्रमित PMVECs से एकत्र supernatants के प्रतिनिधि immunoblots. ब्लाटर्स amyloid (A11) या oligomeric ताऊ (T22) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच कर रहे थे । केडीए में एमआर . कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. सेल की Quantitation हत्या । (एक) प्रतिनिधि सूक्ष्मदर्शी क्षेत्रों से अलग समय अंक (supernatant अतिरिक्त के बाद एच में) जिसमें क्षेत्र और कमी कोशिकाओं के क्षेत्रों में या तो सफेद या काले, क्रमशः, ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए परिवर्तित किया गया । रूपांतरण से पहले इसी फेज की कॉन्ट्रास्ट इमेज भी दिखाई जाती है. बार = १०० µm. (ख) सेल के quantitation की तुलना मानक LDH जारी परख और ImageJ परख का उपयोग कर हत्या । N = 4, * *p < 0.05, * * *p < 0.01 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. प्रतिनिधि थट प्रतिदीप्ति परख डाटा । खाली cuvettes युक्त थट ४२५ एनएम पर उत्साहित थे और फिर उत्सर्जन प्रतिदीप्ति ४८२ एनएम पर मापा गया था । पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति 20 एस के लिए एकत्र किया गया था, और उसके बाद से supernatant या तो PA103-या ΔPcrV-inoculated PMVECs cuvettes में जोड़ा गया था । प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तो ४० सेकंड के लिए दर्ज किया गया था ।

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Discussion

यहां, सरल इन विट्रो विधियों में उल्लिखित जो एक निमोनिया के कारण जीव के साथ संक्रमण के दौरान साइटोटोक्सिक amyloids की पीढ़ी के प्रदर्शन की अनुमति देते हैं । इन तरीकों एक सेल संस्कृति cytotoxicity परख, immunoblotting, सेल के quantitation एक उपंयास सूक्ष्म विधि का उपयोग कर हत्या, और थट बाध्यकारी शामिल हैं । साइटोटोक्सिक एजेंटों के विश्लेषण का प्रदर्शन किया है कि वे प्रकृति में amyloid (चित्रा 2 और चित्रा 4) और एक prion12की विशेषताओं का प्रदर्शन कर रहे हैं । निमोनिया के दौरान साइटोटोक्सिक prion अणुओं की पीढ़ी अपने अस्पताल के निर्वहन के बाद निमोनिया बचे में मनाया ऊंचा मौत दरों के लिए एक संभावित विवरण प्रदान करता है । प्रयोगों की प्रगति में इस संभावना का परीक्षण कर रहे हैं ।

वर्णित अध्ययनों के सभी के लिए महत्वपूर्ण घटना साइटोटोक्सिक supernatant की पीढ़ी है, और दो महत्वपूर्ण चर पर विचार करने की आवश्यकता है । पहले, में उल्लिखित प्रयोगों चूहे PMVECs दोनों संक्रमण कदम के लिए और cytotoxicity परख के लिए इस्तेमाल किया गया । क्या अंय सेल प्रकार cytotoxins के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विस्तार से जांच नहीं की गई है, और यह संभव है कि अंय कोशिकाओं पी aeruginosaके विभिंन उपभेदों के साथ उपचार के बाद साइटोटोक्सिक supernatants उत्पंन करने में सक्षम हो सकता है । के रूप में दिखाया गया है, cytotoxins प्रकृति में amyloid है और oligomeric ताऊ और Aβ शामिल हैं । यह उम्मीद करना उचित हो सकता है कि अन्य कोशिका प्रकार कि व्यक्त ताऊ और/या बीटा amyloid प्रोटीन बैक्टीरियल टीका निम्नलिखित cytotoxins उत्पन्न करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, हालांकि इस संभावना का परीक्षण किया जा करने के लिए रहता है. रेखांकित प्रक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि अंय प्रकार के सेल विभिंन अपमान के बाद साइटोटोक्सिक amyloids उत्पादन प्रेरित किया जा सकता है ।

साइटोटोक्सिक supernatants की पीढ़ी में दूसरा महत्वपूर्ण चर बैक्टीरिया के साथ उपचार की अवधि है । यह आवश्यक है कि PMVECs की मशीन को प्रगति की अनुमति दी जाए जब तक कि अंतराल monolayer में देखा जा सकता है । कोशिका monolayer में अंतराल की पहचान एक संकेत है exoenzymes मेजबान सेल कोशिका द्रव्य में Pseudomonas बैक्टीरिया द्वारा इंजेक्ट किया गया है और यह कि exoenzymes सक्रिय हैं, सेल बॉर्डर्स (चित्रा 1) के पुनर्कर्षण में जिसके परिणामस्वरूप । हमारा अनुभव है कि सेल सीमाओं के त्याग के समय बिंदु supernatant में cytotoxin रिहाई का एक विश्वसनीय संकेतक है । यह अटकलें है कि दो घटनाओं साइटोटोक्सिक amyloids जारी किया जा रहा है में से एक के रूप में संबंधित है मोहक है oligomeric ताऊ, और microtubule depolymerization में ताऊ गतिविधि परिणाम है जो कोशिका आकार परिवर्तन करने के लिए योगदान के विघटन । प्रयोगों में जहां उपचार अंतर गठन प्रेरित करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा से कम किया गया है, थोड़ा परिपक्व साइटोटोक्सिक amyloid का पता लगाया गया है.

इस पांडुलिपि में वर्णित cytotoxicity परख सरल और विश्वसनीय है । कोशिका मृत्यु सूक्ष्म परीक्षण और quantified से सीधे दर्ज सूक्ष्म छवियों से आसानी से मनाया जा सकता है । तरीकों कि यहां वर्णित है विशेष रूप से cytotoxin उत्पादन का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया है चूहे फुफ्फुसीय endothelial कोशिकाओं के साथ पी aeruginosaके संक्रमण के बाद । ऐसा लगता है कि प्रक्रियाओं को आसानी से मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि क्या साइटोटोक्सिक amyloids अन्य निमोनिया के कारण एजेंटों के साथ संक्रमण का उत्पादन कर रहे हैं, दोनों nosocomial जुड़े बैक्टीरिया और बैक्टीरिया और वायरस के लिए जिम्मेदार सहित समुदाय-निमोनिया के प्रकार का अधिग्रहण किया । इसके अलावा, रिपोर्ट की गई प्रक्रियाओं केवल संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के संक्रमण के दौरान साइटोटोक्सिक amyloid पीढ़ी की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । सेल संस्कृति एक कृत्रिम प्रणाली है, और यहां उल्लिखित प्रक्रियाओं सबसे अधिक संभावना दोनों पशु मॉडल और मानव रोगियों के फुफ्फुसीय संक्रमण के दौरान cytotoxins की पीढ़ी का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । bronchoalveolar लेवेज के रूप में जैविक तरल पदार्थ का संग्रह, या तो संक्रमित जानवरों या रोगियों से एक ही प्रकार की परख में इस्तेमाल किया जा सकता है यहां बताया कि साइटोटोक्सिक amyloids vivo में संक्रमण प्रक्रियाओं के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं का आकलन करने के लिए. जाहिर है, बैक्टीरिया के साथ गर्मी की अवधि काफी अलग हो सकता है जब पशुओं में inoculating, और bronchoalveolar लेवेज के लिए एकाधिक समय बिंदु पर एकत्र करने के लिए इलाज की अंतिम अवधि निर्धारित होगा ।

Immunoblot िरा ने यह प्रदर्शित किया है कि amyloids supernatants में मौजूद हैं, जिनमें oligomeric ताऊ और Aβ (चित्रा 3) शामिल हैं । हालांकि immunoblot प्रक्रियाओं मानक हैं, वहां एक महत्वपूर्ण कदम है कि immunoblot विश्लेषण शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए है । विशेष रूप से, यह महत्वपूर्ण है कि संयुक्त राष्ट्र में amyloid की मात्रा के रूप में immunoblotting करने से पहले दस गुना केंद्रित किया जा supernatants-केंद्रित supernatant immunoblot विश्लेषण द्वारा पता लगाने की सीमा से नीचे है । के रूप में यहां की रिपोर्ट, केंद्रापसारक एक फिल्टर से सुसज्जित ट्यूबों का उपयोग कर विधि नियमित रूप से इस एकाग्रता कदम के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह उचित है कि इस तरह के रूप में टीसीए वर्षा के रूप में अंय तरीकों, इस कदम के लिए समान रूप से उपयोगी होगा लगता है ।

सेल के quantitation छवियों का उपयोग कर हत्या एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है । वर्तमान में कोशिका मृत्यु को बढ़ाता है के लिए उपलब्ध प्रक्रियाओं काफी महंगी किट है कि मृत कोशिकाओं से LDH रिहाई के माप की अनुमति की खरीद पर भरोसा करते हैं । परख यहां वर्णित ImageJ प्रोग्राम NIH वेबसाइट से डाउनलोड करने के लिए स्वतंत्र है के रूप में कोई कीमत शामिल है । ImageJ कार्यक्रमों के सरल अनुकूलन सेल की हत्या की काफी सटीक माप की अनुमति देता है । हालांकि, यह संकेत है कि छोटे कलाकृतियों के एक जोड़े को रेखांकित प्रोटोकॉल के प्रदर्शन के दौरान सामना करना पड़ रहा है लायक है । प्रमुख मुद्दा यह है कि इस तरह के फोकल संपर्क के क्षेत्रों के रूप में सेल टुकड़े, कोशिकाओं को मरने के रूप में संस्कृति डिश के साथ जुड़े रह सकते हैं । इन अवशिष्ट कोशिका टुकड़ों कैमरे से पता लगाया जा सकता है और एक कृत्रिम संकेत है कि कोशिकाओं डिश पर रहने दे । जैसे, यह दुर्लभ है कि १००% सेल हत्या के एक मूल्य इस प्रक्रिया का उपयोग कर प्राप्त की है ।

रिपोर्ट की परख प्रणाली की एक कमजोरी यह है कि तैयारी में cytotoxin amyloids कभी पूरी तरह से परिभाषित किया गया है । जैसे, quantitation मुश्किल है । एलिसा परख के लिए विभिंन amyloids के कुल स्तर प्रदान किया जा सकता है, प्रत्येक तैयारी में व्यक्तिगत प्रजातियों के बारे में कोई विस्तृत जानकारी प्रदान करने के बिना । जब तक अधिक सटीक परख, जैसे जन-कल्पना या इन विट्रो में amyloid oligomers संश्लेषित, विकसित किया जा सकता है, सबसे अच्छा है कि एक वर्तमान में कर सकते है करने के लिए कक्षों की एक ही संख्या के साथ प्रत्येक प्रयोग शुरू, एक ही अवधि के लिए मशीन, और सत्यापित करें कि cytotoxicity पिछली तैयारी है कि इस्तेमाल किया गया है के रूप में एक ही दरों पर होता है । अच्छी तरह से स्थापित मानदंडों में से किसी से भिंनता अतिरिक्त अनिश्चितता का परिचय देती है ।

संक्षेप में, इन विट्रो तरीकों में सरल फुफ्फुसीय endothelial कोशिकाओं के साथ एक निमोनिया के कारण एजेंट के साथ संक्रमण के बाद विषाक्त amyloid अणुओं के उत्पादन का प्रदर्शन करने के लिए रेखांकित कर रहे हैं । परख विश्वसनीय और होने की संभावना अंय जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और जैविक तरल पदार्थ का उपयोग कर संक्रमित पशुओं और मानव रोगियों से प्राप्त द्रव । इन तरीकों निमोनिया के दीर्घकालिक परिणामों की जांच और अस्पताल के निर्वहन के बाद रोगियों में अंग विफलता अंत करने के लिए अग्रणी तंत्र की स्थापना के लिए अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

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Disclosures

रिपोर्ट करने के लिए कोई नहीं ।

Acknowledgments

इस अनुसंधान के भागों में NIH अनुदान HL66299 टीएस, आरबी, और SL, HL60024 से टीएस के लिए वित्त पोषित किया गया था, और MF को HL136869 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rabbit anti beta amyloid Thermo 71-5800
A11 amyloid oligomer antibody StressMarq SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody EMD Millipore ABN454
Thioflavin T Sigma Aldrich T3516
HBSS Gibco 14025-092
PBS Gibco 10010-023
0.22 micron syringe filters Millipore SLGP033RS
DMEM Gibco 11965-092
HRP Goat antirabbit IgG Abcam ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin Sigma Aldrich L9381
TRITC Helix pomatia lectin Sigma Aldrich L1261
Agar Fisher BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose BioRad 162-0112
Type 2 collagenase Worthington LS004176
Fetal bovine serum Hyclone SH30898.03IH
PenStrep Gibco 15070063
Carbenicillin Disodium salt Sigma  C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off Millipore UFC801008
Potassium phosphate dibasic Sigma  795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate MP Biomedicals MP021914221
Citric Acid G Biosciences 50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma S9506-500G
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10277

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References

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<em>Pseudomonas aeruginosa</em> द्वारा फुफ्फुसीय Endothelial कोशिकाओं के संक्रमण के बाद साइटोटोक्सिक Amyloids का पता लगाने के लिए तरीके
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Balczon, R., Francis, M., Leavesley, S., Stevens, T. Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (137), e57447, doi:10.3791/57447 (2018).

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