في المختبر تشكيل الكلاب العَدلات فخ خارج الخلية: التحليل الكمي ودينامية بالفحص المجهري الأسفار
Summary
ونحن تصف الأساليب عزل الكلاب العَدلات من الدم كله، ووضع تصور لتشكيل الصافية في العَدلات حية باستخدام مجهر الأسفار. ووصف أيضا بروتوكولات التحديد الكمي لتشكيل الصافية وهيستون سيتروليناتيد H3 التعبير (citH3) باستخدام مجهر الفلورة.
Abstract
ردا على غزو العوامل الممرضة، حرر العَدلات العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات)، وشبكات خارج الخلية للحمض النووي مزينة هيستونيس والبروتينات المضادة للميكروبات. الإفراط في تشكيل الصافي (نيتسيس) والإفراج عن citH3 خلال الانتان يرتبط بالخلل في الجهاز ووفيات في الفئران والبشر متعددة ولكن آثارها في الكلاب غير معروفة. وهنا، يصف لنا تقنية لعزل الكلاب العَدلات من الدم كله للمراقبة والقياس الكمي نيتوسيس. يتم فصل البلازما الغنية بالكريات البيض، التي تم إنشاؤها بواسطة الترسب ديكستران، وسائل الإعلام فصل التدرج الكثافة المتاحة تجارياً وجمعت المحببة لخلية العد واختبار جدوى. لمراقبة نيتسيس في الوقت الحقيقي في العَدلات الحية، الخلية بيرمينت والبقع إيمبيرمينت الحمض النووي الفلورسنت خلية تضاف إلى العَدلات المنشط أما بواسطة lipopolysaccharide (LPS) أو phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية). التغييرات في مورفولوجيا النووية وتشكيل صافي لاحظها مجهرية الأسفار على مر الزمن. في المختبر كذلك يتميز نيتوسيس co-كولوكاليزاتيون خالية من خلايا الحمض النووي (كفدنا)، ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) وهيستون سيتروليناتيد H3 (citH3) باستخدام بروتوكول تعديل مزدوج-إيمونولابيلينج. وكمياً موضوعيا تشكيل الصافية والتعبير citH3 باستخدام مجهر الأسفار، الشباك citH3-إيجابية الخلايا كمياً بشكل أعمى باستخدام البرمجيات المتاحة. هذا الأسلوب مقايسة محددة لتقييم القدرات في المختبر من العَدلات الكلاب البوليسية للخضوع نيتسيس.
Introduction
العَدلات هي المسؤولة عن الدفاع الأولية ضد غزو العوامل الممرضة لم تدم طويلاً المحببة. العَدلات، المعينين إلى موقع الإصابة، القضاء على الكائنات الحية الدقيقة التي البلعمه، وتحبب، وتوليد الأكسجين التفاعلية الأنواع (روس)1. وجود البكتيريا أو اندوتوكسينس، العَدلات الإصدار العَدلات خارج الخلية الفخاخ (شبكات)، تتألف من الكروماتين خارج الخلية مزينة هيستونيس والبروتينات الحبيبية مثل الاستاسي وميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات)2. على الرغم من أن شبكات لها خصائص مضادات الميكروبات لا غنى عنه، تزايد الأدلة التجريبية والسريرية تشير إلى أن تشكيل صافي مفرط خلال الانتان قد يؤدي إلى عدة الجهاز خلل ووفاة3،4، 5 , 6.
نظراً لأن شبكات قد تلعب دوراً الفيزيولوجية المرضية مشابهة في الكلاب، تصلح التدخلات العلاجية التي تمنع أو تقلل من تكوين شبكة استراتيجيات العلاج الرواية في الحيوانات التعفين. لهذا السبب، هناك حاجة لتقنية موثوقة لتقييم وتقدير حجم نيتسيس ومكونات صافي في الكلاب. سابقا قد تم تقييم صافي مكونات بما في ذلك الخلية الحرة الحمض النووي (كفدنا) ونوكليوسوميس في العَدلات الكلاب والبلازما من الكلاب السريرية7،،من89. استخدام فحوصات الأسفار، جوجس وليتيندري وجدت أن الكلاب الانتانية لديها مستويات أعلى من كفدنا من الكلاب صحية8. على الرغم من أن هذه التقنيات موضوعية للغاية والكمية، يتم قياس كفدنا ونوكليوسوميس كعلامات نيتسيس غير محددة نظراً لأنها يمكن أن يستمد من الخلايا نخرية خلاف العَدلات نيتوسينج. هنا يصف لنا أسلوب الذي يستخدم fluorescence الفحص المجهري لدراسة سلوك العيش نيتوسينج العَدلات. ونحن أيضا بالتفصيل بروتوكول تعديل استخدام مزدوج-إيمونولابيلينج لقياس ذاتي الشباك ومكوناتها، مثل الخطة الرئيسية للعمليات و citH3 في العَدلات الكلاب10.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن الحاضرين هنا بروتوكولا لمراقبة التغييرات في الإصدار نويات المطابقة وكفدنا في العَدلات الكلاب الحية باستخدام صبغة بيرميانت خلية وصبغة إيمبيرميانت خلية. والميزة الرئيسية لهذا التحليل أنه يسمح للكشف عن تكوين NET في الوقت الحقيقي بالفحص المجهري عالية الدقة في العَدلات العيش دون تثبيت ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
صاحب المقابلة كانت تموله “مؤسسة الحيوان موريس” (D15CA-907). الدراسة تدعمها الأموال من جامعة كاليفورنيا، ديفيس، ومركز “الصحة الخيول” ومركز “الصحة الحيوانية رفيق” (2016-24-F). الكتاب يود أن ينوه نغ جينا لمساعدتها مع الأرقام ونهى نغوين لمساعدتها مع الفيديو.
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).
