In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza
Summary
Descriviamo i metodi per isolare canini neutrofili dal sangue intero e visualizzare formazione netta nei neutrofili dal vivo utilizzando la microscopia a fluorescenza. Sono anche descritti protocolli per quantificare la formazione netta e citrullinato istone H3 (citH3) espressione usando la microscopia di immunofluorescenza.
Abstract
In risposta ad agenti patogeni d’invasione, neutrofili rilasciare trappole extracellulari del neutrofilo (reti), che sono reti extracellulare del DNA decorato con gli istoni e proteine antimicrobiche. Eccessiva formazione netta (NETosis) e citH3 rilascio durante la sepsi è associato con più disfunzione dell’organo e la mortalità nei topi e nell’uomo ma le sue implicazioni nei cani sono sconosciuti. Qui, descriviamo una tecnica per isolare canini neutrofili dal sangue intero per l’osservazione e la quantificazione dei NETosis. Plasma leucocita-ricco, generato dalla sedimentazione del dextrano, è separato dai mezzi di comunicazione di commercialmente disponibile densità gradiente separazione e granulociti raccolti per conteggio e test di vitalità delle cellule. Per osservare in tempo reale NETosis dal vivo dei neutrofili, cellule permeante e macchie fluorescenti impermeant dell’acido nucleico cellulare vengono aggiunti ai neutrofili attivati da lipopolisaccaride (LPS) o phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA). Cambiamenti nella morfologia nucleare e formazione netta sono osservati nel corso del tempo da microscopia di fluorescenza. In vitro NETosis è ulteriormente caratterizzata da co-colocalizzazione di DNA libero (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) e citrullinato istone H3 (citH3) utilizzando un protocollo modificato di doppio-immunolabelling. Per quantificare oggettivamente formazione netta e citH3 espressione utilizzando la microscopia a fluorescenza, reti e cellule citH3-positive sono quantificate in un modo accecato utilizzando il software disponibile. Questa tecnica è un dosaggio specifico per valutare la capacità in vitro dei neutrofili canini di subire NETosis.
Introduction
I neutrofili sono di breve durati granulociti responsabili della iniziale difesa contro agenti patogeni d’invasione. Neutrofili, reclutati nel sito di infezione, eliminano microrganismi di fagocitosi, la degranulazione e la generazione di ossigeno reattivo (ROS) specie1. In presenza di batteri o endotossine, neutrofili rilascio dei neutrofili extracellulare trappole (reti), composto di cromatina extracellulare decorato con gli istoni e proteine granulari come elastasi e mieloperossidasi (MPO)2. Anche se le reti sono indispensabili proprietà antimicrobiche, crescenti evidenze sperimentali e cliniche suggerisce che troppo zelante formazione netta durante la sepsi può condurre a più organo disfunzione e morte3,4, 5 , 6.
Poiché le reti possono svolgere un simile ruolo patofisiologico nei cani, gli interventi terapeutici che prevenire o diminuiscono formazione netta possono servire da nuove strategie terapeutiche in animali settici. Per questo motivo, c’è la necessità di una tecnica affidabile valutare e quantificare i componenti netti nei cani e NETosis. NET componenti tra cui DNA libero (cfDNA) e nucleosomi sono state valutate in precedenza in neutrofili canini e plasma dai clinici cani7,8,9. Facendo uso delle analisi di fluorescenza, Goggs e Letendre trovato che settici cani hanno livelli elevati di cfDNA rispetto a cani sani,8. Anche se queste tecniche sono altamente oggettiva e quantitativa, misura di cfDNA e nucleosomi come marcatori di NETosis è non specifica, poiché essi possono essere derivate da cellule necrotiche diverso da NETosing neutrofili. Qui descriviamo una tecnica che utilizza la microscopia di fluorescenza per esaminare i comportamenti dei neutrofili NETosing dal vivo. Dettagliamo anche un protocollo modificato utilizzando double-immunolabeling soggettivamente quantificare le reti e i loro componenti quali MPO e citH3 in neutrofili canini10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentiamo qui un protocollo per osservare i cambiamenti nella conformazione e cfDNA i nuclei dei neutrofili canini vivente utilizzando un colorante permeante cella sia un colorante impermeant cella. Il vantaggio principale di questo test è che permette per il rilevamento in tempo reale di formazione netta di microscopia ad alta risoluzione nei neutrofili dal vivo senza fissazione delle cellule, di conseguenza, fornendo uno strumento semplice e prezioso per l’osservazione in vitro formazione netta. Poiché que…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’autore corrispondente è stato finanziato dalla Fondazione di animale Morris (D15CA-907). Lo studio è stato sostenuto dall’Università di California, Davis, centro per la salute equina e centro per la salute animale compagno (2016-24-F). Gli autori desidera ringraziare Geena Ng per la sua assistenza con le figure e Nghi Nguyen per la sua assistenza con il video.
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
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