体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析
Summary
全血からの犬好中球を分離し、蛍光顕微鏡を用いたライブ好中球におけるネットの形成を視覚化する方法について述べる。ネット形成とシトルリン化ヒストン H3 を定量化するプロトコルについて述べる、蛍光顕微鏡を用いた (citH3) 式。
Abstract
病原体の侵入に対し、好中球は DNA のヒストンと抗菌タンパク質の細胞ネットワークである好中球細胞外トラップ (網) をリリースします。過剰なネット形成 (NETosis) 敗血症時に citH3 リリースは複数の臓器障害とマウスとヒトの死亡率に関連付けられて、その犬への影響が知られています。ここで、観察及び定量化 NETosis の全血から犬の好中球を分離する手法について述べる。デキストランの沈降によって生成された白血球リッチ プラズマが市販の密度勾配分離メディアで区切られ、顆粒球の収集細胞数および生存率試験。ライブの好中球におけるリアルタイムの NETosis を観察するには、側の透過物のセルとセルの非透過性蛍光核酸の汚れはリポ多糖 (LPS) またはホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) のいずれかを活性化好中球に追加されます。核の形態とネット形成の変化は、時間をかけて蛍光顕微鏡で観察します。体外NETosis co-3p324 細胞遊離 DNA (cfDNA)、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)、シトルリン化ヒストン H3 (citH3) 変更された二重 immunolabelling プロトコルを使用してが特徴です。ネット形成と蛍光顕微鏡を使用して citH3 式を客観的に定量化するネットし、citH3 陽性細胞が利用可能なソフトウェアを使用して盲検の方法で定量化します。この手法は、特定検定犬の好中球の体外容量 NETosis を受けることに。
Introduction
好中球が顆粒球短命の病原体の侵入に対する最初の防衛を担当です。伝染のサイトに募集、好中球は貪食、脱顆粒反応と活性酸素種 (ROS)1の生成による微生物を排除します。細菌やエンドトキシンの存在下で好中球リリース好中球細胞外トラップ (ネット)、細胞のクロマチンの構成は (MPO)2ヒストンとエラスターゼとペルオキシダーゼのような顆粒内蛋白で装飾されています。ネットでは、不可欠な抗菌特性を持っていますが、実験と臨床の証拠が増えている敗血症時にあまりに熱心なネット形成が複数臓器不全と死3,4、につながる可能性があります。5,6。
ネットは、犬同様の病態生理学的役割を再生可能性があります、ために、ネットの形成を減少または防ぐ治療上の介在は敗血症動物における新しい治療戦略として役立つかもしれない。このため、信頼性の高い手法を評価し、NETosis と犬の NET コンポーネントを数値化するために必要があります。NET コンポーネント (cfDNA) DNA ヌクレオソームなどは以前犬の好中球および臨床犬7,8,9からプラズマで評価されています。蛍光アッセイを使用して、ゴッグスと Letendre 発見健康犬8より cfDNA のハイレベルがある浄化槽犬。これらの技術は高度に客観的・定量的な NETosis のマーカーとして cfDNA とヌクレオソームの測定が非特異的 NETosing 好中球以外壊死細胞から得られるので。ここで好中球 NETosing ライブの挙動を調べる蛍光顕微鏡を利用した手法について述べる。また、ネットと MPO など犬の好中球10citH3 コンポーネントを主観的に定量化する二重反応を使用して修正されたプロトコルの詳細します。
Protocol
Representative Results
Discussion
セル側の透過物色素と細胞の非透過性染料を使用して生活の犬好中球の核形態と cfDNA リリースで変化を観察するためのプロトコルをご紹介します。このアッセイの主な利点は、できるネット形成のリアルタイム計測セル固定せずライブ好中球における高分解能顕微鏡によってしたがって、体外ネット形成を観察するためのシンプルで貴重なツールを提供します。以来、このアッセイは…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
対応する著者モリス動物財団 (D15CA-907) によって資金を供給されました。研究は、カリフォルニア大学、デービス、馬の健康センター、コンパニオン動物保健センターからの資金によって支えられました (2016-24-F)。著者は、数字とギー グエンについて彼女のビデオで彼女の援助ジーナ Ng を認めたいと思います。
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).
