In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence
Summary
Nous décrivons des méthodes pour isoler canines neutrophiles du sang total et de visualiser la formation nette des neutrophiles vivants à l’aide de la microscopie de fluorescence. Également décrites sont des protocoles pour quantifier la formation nette et citrullinés histone H3 (citH3) expression à l’aide de la microscopie par immunofluorescence.
Abstract
En réponse à l’invasion de pathogènes, neutrophiles libèrent les pièges extracellulaires neutrophiles (filets), qui sont des réseaux extracellulaires d’ADN orné d’histones et des protéines antimicrobiennes. La formation nette excessive (NETosis) et citH3 communiqué au cours d’une septicémie est associé avec multiples dysfonctionnement organique et mortalité chez les souris et les humains, mais ses conséquences chez les chiens sont inconnus. Ici, nous décrivons une technique pour isoler les neutrophiles canines du sang total pour l’observation et quantification des NETosis. Plasma leucocyte-riche, générée par la sédimentation de dextran, est séparée par les médias de séparation gradient de densité disponible dans le commerce et granulocytes recueillis pour comte et le contrôle de viabilité des cellules. Pour observer en temps réel NETosis neutrophiles direct, cellule perméant et taches imperméants fluorescents des acides nucléiques cellulaires sont ajoutés à neutrophiles activés par lipopolysaccharide (LPS) ou phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA). Changements dans la morphologie nucléaire et de la formation nette sont observées au fil du temps par microscopie à fluorescence. In vitro NETosis se caractérise davantage par co-co-localisation d’ADN de cellules libres (cfDNA), contre la myéloperoxydase (MPO) et citrullinés histone H3 (citH3) à l’aide d’un protocole modifié de double-immunomarquage. Afin de quantifier objectivement formation nette et citH3 expression à l’aide de la microscopie en fluorescence, filets et cellules citH3-positives sont quantifiés de façon aveugle à l’aide de logiciels disponibles. Cette technique est un dosage spécifique pour évaluer la capacité in vitro des neutrophiles canines à subir une NETosis.
Introduction
Les neutrophiles sont des granulocytes éphémères chargés de la défense initiale contre l’invasion des agents pathogènes. Neutrophiles, recrutés au site d’infection, éliminent les micro-organismes par phagocytose, dégranulation et génération de réactives de l’oxygène (DRO)1. En présence de bactéries ou d’endotoxines, neutrophiles libération neutrophiles extracellulaire pièges (filets), composé de chromatine extracellulaire orné de histones et des protéines granulaires comme l’élastase et contre la myéloperoxydase (FTU)2. Bien que les filets ont des propriétés antimicrobiennes indispensables, augmentant les preuves expérimentales et cliniques suggère que trop zélée formation nette au cours de l’infection peut conduire à plusieurs organes dysfonction et la mort3,4, 5 , 6.
Parce que les filets peuvent jouer un rôle physiopathologique similaire chez les chiens, les interventions thérapeutiques qui empêchent ou diminuent la formation nette peuvent servir de stratégies de nouveaux traitements chez les animaux de la fosse septique. Pour cette raison, il y a un besoin pour une technique fiable évaluer et quantifier des NETosis et des composantes nettes chez les chiens. Composantes nettes y compris ADN acellulaire (cfDNA) et les nucléosomes précédemment ont été évalués que dans les neutrophiles canines et le plasma chiens clinique7,8,9. Utilisant la fluorescence, Goggs et Letendre trouvent que septiques chiens ont des niveaux plus élevés de cfDNA que des chiens en bonne santé8. Bien que ces techniques soient très objective et quantitative, mesure des cfDNA et des nucléosomes comme marqueurs de NETosis est non spécifique car elles peuvent être dérivées de cellules nécrotiques, autres que les neutrophiles NETosing. Nous décrivons ici une technique qui utilise la microscopie de fluorescence pour étudier les comportements des vivants NETosing neutrophiles. Nous détaillons également un protocole modifié à l’aide de double-immunomarquage à quantifier subjectivement les filets et leurs composants tels que le MPO et citH3 dans les neutrophiles canine10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici un protocole afin d’observer les changements de noyaux conformation et cfDNA l’échappement vie canine neutrophiles en utilisant un colorant perméants de cellule et un colorant imperméants de la cellule. Le principal avantage de ce test, c’est qu’elle permet une détection en temps réel de formation nette par microscopie à haute résolution dans les neutrophiles direct sans fixation de la cellule, par conséquent, fournir un outil simple et utile pour l’observation in vitro la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’auteur-correspondant a été financé par la Fondation d’Animal de Morris (D15CA-907). L’étude a été financée par des fonds de l’Université de Californie à Davis, centre de santé équine et Center for Companion Animal Health (2016-24-F). Les auteurs aimerait Geena Ng pour son aide avec les chiffres et Nghi Nguyen pour son aide avec la vidéo.
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
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