במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ
Summary
אנו מתארים שיטות כדי לבודד את הכלבים נויטרופילים של דם מלא, להמחיש את NET-צורה נויטרופילים בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ זריחה. גם המתוארים הם פרוטוקולים לכמת היווצרות נטו, citrullinated היסטון H3 (citH3) ביטוי באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence.
Abstract
בתגובה פתוגנים פולשים, נויטרופילים משחררים מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), אשר הן רשתות חוץ-תאי ה-DNA מעוטרים עם שינויים היסטוניים, חלבונים מיקרוביאלית. היווצרות מופרז נטו (NETosis), citH3 שחרור במהלך אלח דם קשורה בתפקוד איברים מרובים ותמותה בעכברים ובבני אדם אבל השלכותיו אצל כלבים אינם ידועים. במסמך זה, אנו מתארים שיטה לבודד נויטרופילים הכלבי מהדם כל תצפית, כימות של NETosis. ליקוציט עשיר פלזמה, שנוצר על ידי משקעי סחף לתוספי, מופרד באמצעות מדיה ההפרדה הדרגתיות צפיפות זמינים מסחרית ואסף גרנולוציטים עבור תא count ו בדיקות הכדאיות. לצפות NETosis בזמן אמת בנויטרופילים בשידור חי, תא permeant וכתמים impermeant פלורסנט חומצת גרעין התא מתווספים נויטרופילים הופעל על-ידי ליפופוליסכריד (LPS) או 13 12-פעילים phorbol-אצטט (PMA). שינויים מורפולוגיה גרעיני ויצירת רשת שנצפו לאורך זמן על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. במבחנה NETosis מאופיין בהמשך co-colocalization של התא ללא ה-DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) ו- citrullinated היסטון H3 (citH3) באמצעות פרוטוקול כפול-immunolabelling שונה. כדי לכמת באופן אובייקטיבי נטו היווצרות וביטוי citH3 באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, רשתות, תאים citH3-חיוביות הן לכמת באופן עיוור באמצעות תוכנה הזמינים. טכניקה זו היא assay ספציפיים כדי להעריך במבחנה הקיבולת של נויטרופילים הכלבי לעבור NETosis.
Introduction
הנויטרופילים הם אחראים על הביטחון הראשונית נגד פולשים גורמי מחלה קצרת ימים גרנולוציטים. נויטרופילים, גייס לאתר של זיהום, לחסל מיקרואורגניזמים phagocytosis, degranulation ועל הדור של חמצן תגובתי מינים (ROS)1. בנוכחות חיידקים או endotoxins, נויטרופילים שחרור נויטרופילים חוץ-תאית מלכודות (רשתות), המורכבת של כרומטין חוץ-תאית מעוצבים עם שינויים היסטוניים, חלבונים פרטנית כמו elastase myeloperoxidase (MPO)2. למרות רשתות יש מאפיינים מיקרוביאלית הכרחית, הוכחה ניסויית וקלינית גוברת מרמז כי היווצרות נטו נלהב במהלך אלח דם עלול להוביל מספר איברים בתפקוד ומוות3,4, 5 , 6.
כי רשתות עשויים לשחק תפקיד pathophysiological דומה אצל כלבים, התערבויות טיפוליות או למנוע או להפחית את היווצרות נטו עשוי לשמש אסטרטגיות טיפול חדשניים בבעלי חיים ספיגה. מסיבה זו, יש צורך טכניקה אמין להעריך ולכמת NETosis ורכיבים נטו אצל כלבים. רכיבים נטו כולל DNA ללא תא (cfDNA) ו נוקליאוזומים בעבר הוערכו נויטרופילים הכלביים, פלזמה כלבים קליני-7,–8,–9. באמצעות מבחני פלורסצנטיות, Goggs ו- Letendre מצא כי כלבים ספיגה יש רמות גבוהות יותר של cfDNA יותר בריאים הכלבים8. למרות טכניקות אלה הן מאוד אובייקטיביים, כמותיים, מדידה של cfDNA ושל נוקליאוזומים סמנים של NETosis היא לא ספציפית מאז הם הנגזרות תאים עם נמק פרט NETosing נויטרופילים. כאן נתאר טכניקה אשר מנצל פלורסצנטיות מיקרוסקופ כדי לבחון את התנהגויות של נויטרופילים NETosing בשידור חי. אנחנו גם פירוט פרוטוקול ששונתה באמצעות כפול-immunolabeling סובייקטיבי לכמת רשתות ורכיבים שלהם כגון MPO citH3 נויטרופילים הכלבי10.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים כאן פרוטוקול כדי לבחון את השינויים בשחרור קונפורמציה, cfDNA גרעינים נויטרופילים כלבים חיים באמצעות צבע permeant תא והן צבע impermeant תא. היתרון העיקרי של assay הזה הוא שהיא מאפשרת גילוי בזמן אמת של היווצרות נטו על ידי מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה בנויטרופילים לחיות בלי קיבוע תא, לכן, מתן כלי יק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר המקביל מומן על ידי קרן חיה מוריס (D15CA-907). המחקר נתמך על ידי קרנות מן אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, מרכז לבריאות סוסים והמרכז לבריאות בעלי חיים מסייע (2016-24-F). המחברים רוצה להכיר ג’ינה Ng לסיוע שלה עם דמויות ואת נגחי נגוין על הסיוע עם הווידאו.
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).
