Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz
Summary
Biz tam kan gelen köpek nötrofil yalıtmak ve NET canlı nötrofil floresans mikroskobu kullanılarak oluşumunda görselleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca açıklanan NET oluşumu ve citrullinated histon H3 ölçmek için iletişim kurallarıdır ayirt mikroskobu kullanarak (citH3) ifade.
Abstract
Patojenler istila yanıt olarak, nötrofil histon ve antimikrobiyal proteinler ile dekore edilmiş DNA hücre dışı ağları olan ekstraselüler nötrofil tuzakları (ağlar), serbest bırakın. Aşırı NET formasyonu (NETosis) ve citH3 yayın sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve fareler ve insanlar mortalite ile ilişkili ama köpeklerde olan etkileri bilinmemektedir. Burada, tam kan gözlem ve NETosis miktar üzerinden köpek nötrofil yalıtmak için bir teknik açıklar. Lökosit açısından zengin plazma dextran sedimantasyon tarafından oluşturulan, piyasada bulunan yoğunluk gradient ayrılık medya tarafından ayrılmış ve granülosit toplanan hücre sayımı ve Viabilite test. Canlı nötrofil içinde gerçek zamanlı NETosis gözlemlemek için hücre permeant ve hücre impermeant floresan nükleik asit lekeleri nötrofil lipopolysaccharide (LPS) veya phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) tarafından aktive eklenir. Nükleer Morfoloji ve NET oluşumu değişiklikler zamanla floresans mikroskobu tarafından gözlenir. Vitro NETosis daha fazla co-değiştirilmiş bir çift-immunolabelling iletişim kuralı kullanılarak colocalization tarafından boş hücre DNA’ın (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) ve citrullinated histon H3 (citH3) ile karakterizedir. Objektif olarak NET oluşumu ve citH3 ifade floresans mikroskobu, kullanarak ölçmek için ağlar ve citH3 pozitif hücreleri mevcut yazılım kullanarak kör bir şekilde sayılabilir. Bu teknik NETosis geçmesi köpek nötrofil vitro kapasitesini değerlendirmek için belirli bir tahlil olduğunu.
Introduction
Nötrofil kısa ömürlü granülosit patojenler istila karşı ilk savunma sorumlu vardır. Nötrofiller, enfeksiyon, siteye işe mikroorganizmalar tarafından fagositoz, degranulation ve reaktif oksijen türleri (ROS)1nesil ortadan kaldırmak. Bakteri veya endotoxins huzurunda, nötrofil yayın nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), hücre dışı kromatin oluşan histon ve elastase ve myeloperoxidase gibi taneli proteinler (MPO)2süslenmiş. NETs vazgeçilmez antimikrobiyal özellikleri olsa da, deneysel ve klinik kanıt artan hevesli NET oluşumu sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve ölüm3,4‘ e, neden olabilir gösteriyor 5 , 6.
NETs köpeklerde benzer bir patofizyolojik rol oynayabilir çünkü önlemek veya azaltmak NET oluşumu tedavi müdahaleler roman tedavi stratejileri septik hayvanlarda olarak hizmet verebilir. Bu nedenle, güvenilir bir teknik NETosis ve köpeklerde NET bileşenler ölçmek ve değerlendirmek için bir ihtiyaç vardır. NET bileşenleri boş hücre DNA (cfDNA) ve oluşturarlar dahil olmak üzere daha önce köpek nötrofil ve plazma klinik köpekler7,8,9değerlendirilir. Floresans deneyleri kullanarak, Goggs ve Letendre septik köpeklerin cfDNA yüksek düzeyde sağlıklı köpekler8‘ den vardır bulundu. Bu teknikler son derece objektif ve nicel olmakla birlikte, onlar NETosing nötrofil dışında nekrotik hücrelerden elde edilebilir bu yana oluşturarlar ve cfDNA NETosis işaretleri olarak non-spesifik ölçümdür. Burada floresans mikroskobu canlı NETosing nötrofil davranışları incelemek için kullanan bir tekniğini tanımlamak. Biz de subjektif ağlar ve bileşenlerinin MPO ve citH3 köpek nötrofil10gibi ölçmek için çift-immunolabeling kullanan bir değiştirilmiş Protokolü ayrıntı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada değişmek içinde çekirdek uyum ve cfDNA serbest bırakmak içinde yaşayan köpek nötrofil hücre permeant boya ve bir hücre impermeant boya kullanarak gözlemlemek için bir protokol mevcut. Bu tahlil en büyük avantajı bu NET oluşumu gerçek zamanlı algılama için yüksek çözünürlüklü mikroskobu canlı nötrofil hücre fiksasyon, olmadan tarafından bu nedenle, vitro NET oluşumu gözlemlemek için basit ve değerli bir araç sağlayan sağlanmıştır. Bu tahlil NET bileşenler tespiti …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarın Morris hayvan Vakfı (D15CA-907) tarafından finanse edildi. Çalışma fon University of California, Davis, Equine Sağlık Merkezi ve refakatçi hayvan sağlığı merkezi tarafından desteklenmiştir (2016-24-F). Yazarlar Geena Ng onun hakkında yardım almak için rakamlar ve Nghi Nguyen video ile yardımını kabul etmek istiyorum.
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).
