В пробирке Формирование собак нейтрофилов внеклеточного ловушка: Динамические и количественный анализ по микроскопии флуоресцирования
Summary
Мы описываем методы изолировать собак нейтрофилов из цельной крови и визуализировать NET формирования в живой нейтрофилов, с помощью микроскопии флуоресцирования. Также описаны протоколы для количественного определения чистой формирования и citrullinated гистонов H3 выражение (citH3), с помощью микроскопии иммунофлуоресценции.
Abstract
В ответ на вторжение патогенов нейтрофилов освобождение нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), которые являются внеклеточного сети ДНК, украшенные Гистоны и антимикробные белки. Чрезмерная NET формирования (NETosis) и citH3 релиз во время сепсиса ассоциируется с несколькими полиорганной дисфункции и смертности в мышей и людей, но его последствия в собак неизвестны. Здесь мы опишем технику, чтобы изолировать собак нейтрофилов из цельной крови для наблюдения и количественной оценки NETosis. Лейкоцитов богатые плазмы, порожденных декстрана седиментации, разделенных коммерчески доступных плотность градиента разделения средств массовой информации и гранулоцитов, собранные для мобильных игр и проверки жизнеспособности. Для наблюдения в реальном времени NETosis в живых нейтрофилов, permeant клеток и клеток impermeant флуоресцентные нуклеиновых кислот пятна добавляются нейтрофилов, активированный липополисахарида (LPS) или phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA). Изменения в ядерной морфологии и чистой формирования наблюдаются со временем по микроскопии флуоресцирования. В пробирке NETosis также характеризуется co-colocalization свободных клеток ДНК (cfDNA), миелопероксидаза (МПО) и citrullinated гистонов H3 (citH3) с помощью модифицированных двойной immunolabelling протокола. Чтобы объективно подсчитать чистый формирования и citH3 выражение, с помощью микроскопии флуоресцирования, сетки и citH3-положительных клеток являются количественно в ослепленный манере с использованием доступного программного обеспечения. Эта техника является конкретным пробирного для оценки в vitro способности собак нейтрофилов пройти NETosis.
Introduction
Нейтрофилы являются недолго гранулоцитов ответственных за первоначальный обороны против вторгаясь патогенов. Нейтрофилы, набранных на месте инфекции, устранения микроорганизмов, фагоцитоз, дегрануляция и поколения реактивнооксигенных видов (ров)1. Присутствии бактерий или эндотоксинов нейтрофилов освобождение нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), состоит из внеклеточного хроматина украшен Гистоны и гранулированный белки как эластазы и миелопероксидаза (МПО)2. Хотя сеток незаменимым противомикробными свойствами, увеличивая экспериментальных и клинических доказательств свидетельствует о том, что фанатичным NET формирования во время сепсис может привести к нескольким орган дисфункции и смерти3,4, 5 , 6.
Потому что сети могут играть аналогичную роль патофизиологических в собак, терапевтических вмешательств, которые либо предотвратить или уменьшить NET формирования может служить стратегии Роман лечения в септик животных. По этой причине существует необходимость надежный метод для определения и количественной оценки NETosis и чистых компонентов в собак. NET компонентов, включая свободных клеток ДНК (cfDNA) и нуклеосом ранее были оценены в собачьей нейтрофилов и плазмы от клинических собак7,8,9. Использование флуоресценции анализов, Goggs и Letendre обнаружил, что септик собаки имеют более высокий уровень cfDNA чем здоровые собаки8. Хотя эти методы являются весьма объективные и количественных, измерение cfDNA и нуклеосом как маркеры NETosis неспецифической, так как они могут быть производными от некротических клеток, кроме NETosing нейтрофилов. Здесь мы описываем метод, который использует микроскопии флуоресцирования для изучения поведения живых NETosing нейтрофилов. Мы также подробно измененный Протокол, с помощью двойного immunolabeling субъективно количественной оценки сетей и их компонентов, таких как МПО и citH3 в собачьей нейтрофилов10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем здесь протокол наблюдать изменения в конформации и cfDNA версии ядра в живых собак нейтрофилов, используя permeant красителя клетки и клетки impermeant краситель. Основным преимуществом этот assay является, что он позволяет для реального времени обнаружения чистой формирования при …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Соответствующего автора финансировался Фондом животных Моррис (D15CA-907). Исследование было поддержано средств из университета Калифорнии, Дэвис, центр для Equine здоровья и центра по охране здоровья животных компаньон (2016-24-F). Авторы хотели бы признать Джина нг за помощь с фигурами и Нгуен Nghi за помощь с видео.
Materials
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).
