أساليب لتقييم دور ج-المنحدر و Dusp1 في الاعتماد على السرطاني
Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكولات المصادقة الوراثية والكيميائية ج-المنحدر و Dusp1 كهدف المخدرات في سرطان الدم باستخدام الماوس الوراثية وأنسنة في المختبر والمجراه في نماذج. يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي هدف للتحقق من الصحة الوراثية والتنمية العلاجية.
Abstract
مظاهرة تيروزين كيناز مثبطات (تكيس) في علاج سرطان الدم النقوي المزمن (CML) وقد يبشر بعهد جديد في علاجات السرطان. ومع ذلك، عدد صغير من الخلايا لا تستجيب ل TKI العلاج، أسفر عن الأمراض المتبقية الحد الأدنى (MRD)؛ فشل تكيس حتى أقوى للقضاء على هذه الخلايا. هذه الخلايا MRD بمثابة مستودع تطوير مقاومة للعلاج. ولا يعرف لماذا غير فعال ضد الخلايا MRD TKI العلاج. عامل النمو مما يشير إلى تورط في دعم بقاء الخلايا MRD أثناء TKI العلاج، ولكنها تفتقر إلى فهم ميكانيكية. الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن المنحدر ج مرتفعة وتعبير Dusp1 نتيجة متقاربة النمطان وعامل النمو الإشارات في الخلايا MRD التوسط المقاومة TKI. يجعل التضليل الحساسة رائع تكيس تثبيط الوراثية والكيميائية ج-المنحدر و Dusp1 ويشفي التضليل في كلا النموذجين الوراثي وأنسنة الماوس. وقد حددنا هذه الجينات المستهدفة باستخدام عدة [ميكروارس] من TKI-حساسة-وخلايا مقاومة. هنا، نحن نقدم طرق للتحقق من صحة الهدف باستخدام الماوس في المختبر والمجراه في النماذج. يمكن بسهولة تطبيق هذه الأساليب على أي هدف للتحقق من الصحة الوراثية والتنمية العلاجية.
Introduction
يؤدي النشاط كيناز تيروزين التأسيسي للمركز-ABL1 الانصهار السرطاني التضليل، الذي يوفر الأساس منطقي لاستهداف النشاط كيناز بمثبطات جزيء صغير. نجاح تكيس في علاج مرضى CML أحدثت ثورة في مفهوم العلاج المستهدفة1،2. وفي وقت لاحق، قد وضعت كيناز المضادة العلاج كدواء الدقة لعدة الأورام الخبيثة الأخرى، بما في ذلك الأورام الصلبة. وحتى الآن، أكثر من ثلاثين kinase مثبطات أقرها “المتحدة الدولة إدارة الأغذية والعقاقير” لعلاج الأورام الخبيثة المختلفة. بينما TKI العلاج فعالة جداً في القضاء على هذا المرض، إلا أنها ليست العلاجية. وعلاوة على ذلك، استمر عدد صغير من الخلايا السرطانية أثناء فترة العلاج:4،3،5. وبقي حتى المرضى الذين أظهر مغفرة كاملة مع MRD، التي قمعت في نهاية المطاف نتائج في الانتكاس إذا لم يكن بشكل مستمر. ولذلك، يلزم القضاء على الخلايا MRD لتحقيق استجابة دائمة أو العلاجية. التضليل يمثل نموذجا قيماً لتعريف مفهوم الطب الدقة، وآليات أونكوجينيسيس والعلاجات الموجهة الهدف الرشيد، وتطور المرض والمقاومة للعقاقير. ومع ذلك، وحتى اليوم، إليه القيادة موت الخلايا المستحثة TKI في الخلايا السرطانية ليست مفهومة تماما، ولا لماذا MRD الخلايا (التي تتألف من الخلايا الجذعية ليوكيميك []) مقاومة جوهريا تكيس4،6. على الرغم من ذلك، هو ظاهرة “السرطاني الاعتماد” إلى أونكوبروتين كيناز متحولة المتورطين في فعالية TKI حيث يسبب تثبيط السرطاني المستهدفة تكيس الحاد حدوث صدمة النمطان التي تؤدي إلى استجابة بروابوبتوتيك ضخمة أو التتابع في الخلية طريقة تعتمد على السياق6،7،،من89. ومع ذلك، تفتقر إلى الأساس آليا للاعتماد السرطاني. وقد تورط الدراسات الأخيرة أن إشارات عامل النمو ويلغي الاعتماد السرطاني ويضفي عليه مقاومة TKI العلاج10،،من1112. ولذلك، للحصول على نظرة ثاقبة إليه الاعتماد السرطاني، أجرينا التعبير كل الجينوم التنميط من المركز-ABL1 مدمن والخلايا نوناديكتيد (نمت مع عوامل النمو)، التي كشفت عن أن ج-المنحدر و Dusp1 من الوسطاء الحرجة من إدمان السرطاني13. حذف الوراثية ج-المنحدر و Dusp1 الخلايا القاتلة للتعبير عن ABL1 بنك الاصطناعية والفئران استخدمت في التجربة لم يطور سرطان الدم. وعلاوة على ذلك، شُفي تثبيط ج-المنحدر و DUSP1 بمثبطات جزيء صغير التضليل التي يسببها ABL1 بنك في الفئران. وتبين النتائج أن مستويات التعبير ج-المنحدر و Dusp1 بتحديد عتبة أبوبتوتيك في الخلايا السرطانية، حيث أن المستويات الأدنى يضفي حساسية المخدرات بينما تسبب ارتفاع مستويات مقاومة للعلاج13.
تحديد الجينات القيادة الاعتماد السرطاني، أجرينا عدة التعبير كل الجينوم التنميط تجارب حضور عامل النمو و TKI (imatinib) باستخدام كلا الماوس-والتضليل المستمدة من المريض خلايا (K562). وجرى تحليل هذه البيانات بالتوازي مع التضليل المريض مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من CD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم قبل وبعد العلاج مع imatinib. كشف هذا التحليل عن ثلاثة جينات (عامل النسخ [ج-المنحدر]، وخصوصية المزدوج الفوسفاتيز 1 [Dusp1]، والحمض النووي الريبي ملزمة بروتين [Zfp36]) الذي يشيع أوبريجولاتيد في خلايا مقاومة TKI. للتحقق من أهمية هذه الجينات في منح المقاومة للعقاقير، قمنا بتنفيذ التحليل في المختبر و في فيفو خطوة بخطوة. وأكدت مستويات التعبير هذه الجينات قبكر في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) وغربي النشاف في خلايا مقاومة للأدوية. علاوة على ذلك، كدنا overexpression وضربه قاضية بدبابيس الشعر شرنا من ج-المنحدر، Dusp1، و Zfp36 كشفت أن مرتفعة ج-المنحدر والتعبيرات Dusp1 الكافية واللازمة لمنح المقاومة TKI. ولذلك، أجرينا المجراة في التحقق من صحة باستخدام نماذج الماوس مع ج-المنحدر و Dusp1 فقط. للتحقق من الصحة الوراثية ج-المنحدر و Dusp1، ونحن إنشاء روساكريرت-إيندوسيبلي ج-المنحدرfl/fl الفئران (خروج المغلوب الشرطي)14 وعبرت لهم مع Dusp1-/- (خروج المغلوب على التوالي)15 جعل ROSACreERT2-ج–المنحدرfl/fl Dusp1-/- الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة. الخلايا المشتقة من نخاع العظم ج-كيت+ (من ج-المنحدرfl/فلوريدا-، Dusp1–/––، وج-المنحدرfl/flDusp1–/–) معربا عن المركز-ABL1 قد تم تحليلها في المختبر في تشكيل مستعمرة المقايسة وحدة (زيمبابوي)، و في فيفو بزرع نخاع العظام في الفئران المشععة قاتلة، لاختبار شرط ج-المنحدر و Dusp1 منفردة أو مجتمعة في تطور سرطان الدم. وبالمثل، الموانع الكيميائية ج-المنحدر من DFC (ديفلوريناتيد الكركمين)16 و Dusp1 من BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 تم اختبارها في المختبر والمجراه في استخدام المركز-ABL1-الإعراب عن، العظام الخلايا المشتقة من نخاع ج-كيت+ من الماوس (WT) البرية من نوع. لتأكيد شرط ج-المنحدر و Dusp1 في الخلايا الجذعية ليوكيميك، نحن تستخدم نموذج ماوس التضليل حيث حملت ABL1 المركز على وجه التحديد في خلاياه الجذعية الدوكسي (تعرب عن ترانساكتيفاتور تيت تحت الخلايا الجذعية موريني اللوكيميا (SCL) الجين 3 ‘ محسن لائحة)18،19. قمنا باستخدام نخاع العظام لين–الخلايا Sca++ (LSK) ج-مجموعة من هذه الفئران في مقايسة المجراة في زرع. وعلاوة على ذلك، أنشأنا مستويات فوبشو-p38 والتعبير عن إيل-6 كالمؤشرات الحيوية الديناميكية دراسة معمقة من العقاقير Dusp1 وتثبيط ج-المنحدر، على التوالي، في فيفو. وأخيراً، توسيع نطاق الدراسة للبشرية أهمية، المستمدة من المريض CD34+ الخلايا (ما يعادل الخلايا ج-كيت+ من الفئران) كانت تعرض على المدى الطويل في المختبر الشروع في ثقافة الخلية فحوصات (لتسيك) ونموذج ماوس أنسنة المجراة في التضليل20،21. تم زرع الفئران العوز مع التضليل CD34 + الخلايا، متبوعاً بالعلاج من تعاطي المخدرات وتحليل لبقاء الخلية ليوكيميك البشرية.
في هذا المشروع، نقوم بوضع أساليب لتحديد الهدف وعمليات التحقق من الصحة باستخدام الأدوات الجينية والكيميائية على حد سواء، باستخدام نماذج الإكلينيكية المختلفة. يمكن تطبيق هذه الأساليب بنجاح التحقق من صحة الأهداف الأخرى تطوير الطرائق الكيميائية للتنمية العلاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجزء الأكبر من الخلايا السرطانية، هو توسط الاستجابة العلاجية ل TKI حصار تيروزين-كيناز-أونكوبروتين الإشارات التي الورم مدمن. ومع ذلك، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول كيفية الهروب أقلية خلايا السرطانية التي تساهم الاعتماد والعلاج السرطاني4. كشفت الدراسات الأخيرة أن يشير إلى عامل …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب ممتنون لدالي س. غ. لتوفير خلايا BaF3 و WEHI و “ريا ت.” مسكف-المركز-ABL-آيريس–يفب بنيات. الكتاب ممتنون كارول م. لتوفير عينات المرضى من أزمة انفجار التضليل. هذه الدراسة وأيد منح للماجستير من لجنة التحقيق الوطنية (1RO1CA155091) ومؤسسة أبحاث سرطان الدم ومؤسسة الخامس، ومن نهلبي (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
Referências
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O’Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and “oncogenic shock”. Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes–the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- . Qiagen-miRNAeasy kit Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018)
- . DNA-free DNA removal kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018)
- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
