שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן
Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקולי האימות גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 כמטרה סמים בלוקמיה באמצעות העכבר גנטי, humanized במבחנה ויוו מודלים. בשיטה זו ניתן ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.
Abstract
ההדגמה של מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) בטיפול לוקמיה מיאלואידית כרונית (CML) יש בישרה עידן חדש ותרופות לסרטן. עם זאת, אוכלוסיה קטנה של תאים אינו מגיב לטיפול TKI, והתוצאה היא מחלה שיורית מינימלית (MRD); אפילו הכי חזק TKIs להיכשל כדי למגר תאים אלה. תאים אלה MRD לשמש מאגר לפתח עמידות לטיפול. למה TKI הטיפול אינו יעיל נגד MRD תאים לא ידוע. גורם הגדילה איתות הייתה שם בתמיכה ההישרדות של MRD תאים במהלך הטיפול TKI, אך הבנה מכניסטית לוקה בחסר. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו c מוגברות-פוס ואת הביטוי Dusp1 כתוצאה מתכנסת oncogenic פקטורי גדילה איתות בתאים MRD לתווך TKI ההתנגדות. עיכוב גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 מעבד לוקמיה מיאלואידית כרונית רגישים להפליא TKIs ומרפא CML בשני המודלים העכבר humanized גנטי. זוהו הגנים האלה היעד באמצעות מיקרו-מערכים מרובים TKI רגיש ותאים עמידים. כאן, אנו מספקים שיטות אימות היעד באמצעות העכבר במבחנה ויוו מודלים. שיטות אלה ניתן בקלות ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.
Introduction
פעילות קינאז טירוזין המכונן של BCR-ABL1 פיוז’ן אונקוגן גורמת CML, אשר מהווה הרציונל למקד את פעילות קינאז על ידי מעכבי מולקולה קטנה. ההצלחה של TKIs בטיפול בחולי CML מהפכה הקונספט של טיפול ממוקד1,2. לאחר מכן, טיפול אנטי-קינאז כתרופה דיוק פותחה עבור מספר ממאירויות אחרות, כולל גידולים מוצקים. עד כה, מעכבי קינאז יותר משלושים אושרו על ידי ה יונייטד המדינה-FDA לטיפול גידולים ממאירים שונים. בעוד TKI טיפול יעיל מאוד בדיכוי המחלה, זה לא מרפא. חוץ מזה, אוכלוסיה קטנה של תאים סרטניים נמשכת במהלך הטיפול:4,3,MRD5. אפילו חולים אשר הראו הפוגה מלאה נשארים עם MRD, אשר בסופו של דבר התוצאות ב- relapse אם לא באופן רציף מודחקים. לכן, מיגור של MRD תאים נדרש כדי להשיג היענות עמיד או ריפוי. לוקמיה מיאלואידית כרונית מייצג פרדיגמה ערך להגדרת המושג דיוק רפואה, מנגנונים של oncogenesis, הרפוי רציונלי מכוון מטרה, התקדמות המחלה תרופתיים. עם זאת, גם היום, מנגנון נהיגה מוות תאי TKI-induced בתאי סרטן אינה מובנת במלואה, ולא למה תאים MRD (המורכב של תאי גזע לוקמיה [LSCs]) עמידים ממהותם4,TKIs6. למרות זאת, התופעה של “תלות אונקוגן” כדי oncoprotein קינאז מוטציה הוא בהפרות יעילות TKI איפה עיכוב חריפה של יישוב אונקוגן מאת TKIs גורם מכת oncogenic שמוביל מסיבי proapoptotic תגובה או תרדמה בתא באופן תלוי-ההקשר6,7,8,9. עם זאת, בהתפשטות אונקוגן התלות מכניסטית לוקה בחסר. מחקרים שנעשו לאחרונה לסבך כי גורם הגדילה איתות abrogates אונקוגן התלות, כתוצאה מכך מקנה עמידות TKI טיפול10,11,12. לכן, כדי לזכות בתובנה המנגנון של אונקוגן התלות, ביצענו הגנום כולו ביטוי פרופיל של BCR-ABL1 מכורים ותאים nonaddicted (גדל עם גורמי גדילה), אשר גילה ש- c-פוס ו Dusp1 הם מתווכים קריטי של אונקוגן התמכרות13. המחיקה גנטי של c-פוס, Dusp1 תאים קטלניים BCR-ABL1-ולהבעת סינתטי, העכברים המשמשים את הניסוי לא לפתח לוקמיה. יתר על כן, עיכוב של c-פוס, DUSP1 על ידי מעכבי מולקולה קטנה נרפא BCR-ABL1-induced CML בעכברים. התוצאות מציגות רמות הביטוי של c-פוס, Dusp1 להגדיר את סף מוות של תאים סרטניים, כזה כי רמות נמוכות יותר להתייעץ סמים רגישות בעוד רמות גבוהות יותר לגרום התנגדות טיפול13.
כדי לזהות את הגנים נהיגה התלות אונקוגן, ביצענו כמה הביטוי הגנום כולו פרופיל ניסויים בנוכחות גורם הגדילה של TKI (imatinib) באמצעות העכבר – והן תאים נגזר חולה CML (K562). נתונים אלה נותחו במקביל עם ערכות נתונים חולה CML המתקבל CD34+ hematopoietic תאי גזע לפני ואחרי הטיפול בעזרת imatinib. ניתוח זה חשף בשלושה גנים (גורם שעתוק [c-פוס], ירידה לפרטים כפול פוספטאז 1 [Dusp1], ולא של RNA-מחייב חלבון [Zfp36]) אשר הם בדרך כלל upregulated תאים עמידים TKI. כדי לאמת את המשמעות של גנים אלו משוחח עמידות לתרופות, אנחנו ביצעו ניתוח במבחנה , ויוו צעד אחר צעד. רמות ביטוי של גנים אלה שאושרו על-ידי qPCR בזמן אמת (RT-qPCR), סופג המערבי תאים עמידים לתרופות. יתר על כן, ביטוי cDNA של נוקאאוט מאת shRNA סיכות של c-פוס, Dusp1, Zfp36 גילה כי c מוגברות-פוס וביטויים Dusp1 הם מספיק והכרחי להיוועץ TKI ההתנגדות. לכן, אנו לבצע אימות ויוו באמצעות העכבר מודלים עם c-פוס Dusp1 בלבד. לשם אימות גנטי של c-פוס, Dusp1, אנו נוצר c-פוסחליל/חליל ROSACreERT-inducible עכברים (מותנה נוקאאוט)14 , חצה אותם עם Dusp1– / – (ישר נוקאאוט)15 כדי להפוך ROSACreERT2-c-פוסחליל/חליל Dusp1– / – העכברים הטרנסגניים-כפול. תאי מח עצם-derived c-Kit+ (מ- c-פוסחליל/חליל-, Dusp1– / –-, ו- c-פוסחליל/חלילDusp1– / –) המבטאת BCR-ABL1 היו שנותחה במבחנה המושבה יוצרי assay יחידה (CFU), ו . ב ויוו על ידי השתלת מח עצם בעכברים אולם לקרינה, כדי לבדוק את הדרישה של c-פוס, Dusp1 לבד או יחד בפיתוח לוקמיה. באופן דומה, העכבות כימי של c-פוס DFC (difluorinated כורכומין)16 , Dusp1 על ידי BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 נבדקו במבחנה, ויוו באמצעות BCR-ABL1-המבטאת עצם תאי מח-derived c-Kit+ מן העכבר (WT) פראי-סוג. כדי לאשר את הדרישה של c-פוס, Dusp1 בתאי גזע לוקמיה, אנחנו מנוצל דגם העכבר CML איפה BCR-ABL1 היה במיוחד שנגזרות בתאי גזע שלו דוקסיציקלין (ט-transactivator מבטא תחת מאתר תאי לוקמיה (SCL) הגן 3′ משפר… תקנה)18,19. השתמשנו מח עצם לין–סרוק+c-Kit+ (LSK) תאים מחלון אלו עכברים ב וזמינותו השתלת ויוו. יתר על כן, הקמנו phopsho-p38 רמות, הביטוי של IL-6 כמו דינמי-טוהר הפרמה קופ סמנים ביולוגיים עבור Dusp1 וניגוד c-פוס, בהתאמה, ויוו. לבסוף, כדי להרחיב את המחקר עבור רלוונטיות האדם, נגזר החולה CD34+ תאים (המקביל בתאי c-Kit+ של עכברים) היו כלפיהן לטווח ארוך במבחנה. מתחילה תרבות תא מבחני (LTCIC) ומודל העכבר humanized ויוו של לוקמיה מיאלואידית כרונית20,21. העכברים immunodeficient הושתלו עם לוקמיה מיאלואידית כרונית CD34 + תאי, ולאחריו הטיפול בתרופה וניתוח של הישרדות cell לוקמיה אנושי.
בפרויקט זה, אנו מפתחים שיטות זיהוי המטרה והאימותים באמצעות כלים גנטיים והן כימית, שימוש במודלים פרה שונה. שיטות אלה ניתן להחיל בהצלחה כדי לאמת את מטרות נוספות לפתח שיטות כימיות לפיתוח טיפולית.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבור חלק הארי של תאים סרטניים, התגובה הטיפולית TKI מתווך על ידי מצור של אותות טירוזין-קינאז-oncoprotein אשר הגידול הוא מכור. עם זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על איך מיעוט של תאים סרטניים לתרום MRD לברוח אונקוגן התלות וטיפול4. מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי גורם הגדילה איתות שמתווכת תרופתיים לוק…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ל ג ש דיילי למתן התאים BaF3 ועל ה-וואי ובונה רייה ט עבור MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP. המחברים מודים ל מ קרול למתן דגימות החולה מן המשבר הפיצוץ לוקמיה מיאלואידית כרונית. מחקר זה נתמך על ידי מענקים כדי M.A. מ- NCI (1RO1CA155091), לוקמיה Research Foundation, קרן V ומ NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
Referências
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O’Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and “oncogenic shock”. Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes–the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- . Qiagen-miRNAeasy kit Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018)
- . DNA-free DNA removal kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018)
- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
