C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri
Summary
Burada, c-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal doğrulama uyuşturucu hedef olarak tüp bebek ve içinde vivo genetik ve insanlaşmış fare modelleri kullanarak lösemi için iletişim kuralları açıklar. Bu yöntem, herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için uygulanabilir.
Abstract
Tirozin kinaz inhibitörleri (TKIs) kronik miyeloid lösemi (CML) tedavisinde gösteri kanser tedavi yeni bir dönemin habercisi. Ancak, küçük bir nüfus hücre TKI tedavi için minimal rezidüel hastalık (MRD); kaynaklanan yanıt vermiyor Bu hücreler ortadan kaldırmak için bile en güçlü TKIs başarısız. Bu MRD hücreler tedaviye direnç geliştirmek için bir depo olarak hizmet vermektedir. Neden TKI tedavi MRD hücreleri karşı etkisiz bilinmemektedir. Büyüme faktörü sinyal MRD hücreleri hayatta kalma TKI tedavisi sırasında destek karıştığı, ama mekanik bir anlayış eksik. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bir yükseltilmiş c-Fos ve yakınsak bir sonucu olarak Dusp1 ifade oncogenic ve büyüme faktörü MRD hücreleri sinyal TKI direnç aracılık gösterdi. C-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal inhibisyonu CML TKIs zarif duyarlı işler ve her iki genetik ve insanlaşmış fare modellerinde CML tedavileri. TKI-duyarlı ve – dayanıklı hücreleri birden çok microarrays kullanarak bu hedef genlerin tespit edilmiştir. Burada, biz tüp bebek ve içinde vivo fare modelleri kullanarak hedef doğrulama için yöntemler sağlar. Bu yöntemlerin herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme kolayca uygulanabilir.
Introduction
Kurucu Tirozin kinaz aktivitesinin BCR-ABL1 füzyon onkogen kinaz aktivitesi küçük molekül inhibitörleri tarafından hedeflemek için bir gerekçe sağlar CML neden olur. CML hastaların tedavisinde TKIs başarısı hedefe yönelik tedavi1,2kavramı devrim. Daha sonra anti-kinaz terapisi hassas ilaç olarak solid tümör dahil olmak üzere birçok diğer maligniteler için geliştirilmiştir. Şimdiye kadar otuzdan fazla kinaz inhibitörleri çeşitli maligniteler tedavisi için United State FDA tarafından onaylanmıştır. TKI tedavi hastalık bastırmak çok etkili olmakla birlikte, iyileştirici değil. Ayrıca, tedavi sırasında kanser hücrelerinin küçük bir nüfus devam ederse: MRD3,4,5. Tam iyileşme gösterdi bile hasta sonunda sonuçları nüks içinde değilse sürekli bastırılmış MRD ile bırakılır. Bu nedenle, MRD hücreleri eradikasyonu dayanıklı veya tedavi edici bir yanıt elde etmek için gereklidir. CML tanımlama hassas tıp kavramı, oncogenesis, rasyonel hedef yönelik tedavi, hastalık ilerleme ve ilaç direnci mekanizmaları için değerli bir paradigma temsil eder. Ancak, bugün bile, TKI indüklenen hücre ölümü kanser hücrelerinde sürüş mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır, ne de neden MRD hücreleri (lösemik kök hücrelerinin [LSCs] oluşan) TKIs4,–6özünde dayanıklı. Yine de, mutant kinaz oncoprotein için “onkogen bağımlılık” olgusu içinde nereye TKIs tarafından hedeflenen onkogen akut inhibisyonu bir büyük proapoptotic yanıt ya da sendika hücredeki yol açan bir oncogenic şok neden TKI etkinliği karıştığı içerik bağımlı bir şekilde6,7,8,9. Ancak, mekanik destek onkogen bağımlılığı eksik. Son yıllarda yapılan çalışmalarda büyüme faktörü sinyal onkogen bağımlılığı abrogates ve sonuç olarak direnç TKI terapi10,11,12confers karıştığı. Bu nedenle, onkogen bağımlılığı mekanizmasının bir anlayış kazanmak için biz bütün-genom ifade BCR-ABL1 bağımlısı ve nonaddicted hücreleri (büyüme faktörleri ile büyüdü), c-Fos ve Dusp1, kritik arabulucu olduğunu ortaya profil oluşturma gerçekleştirilen onkogen bağımlılığı13. C-Fos ve Dusp1 genetik silinmesi sentetik BCR-ABL1 ifade etmek için öldürücü hücreler ve deneyde kullanılan farelerde lösemi geliştirmek değil. Ayrıca, c-Fos ve DUSP1 inhibisyonu küçük molekül inhibitörleri tarafından BCR ABL1 indüklenen CML farelerde tedavi. Öyle ki daha yüksek düzeyleri terapi13direnç neden iken alt düzey ilaç duyarlılığı görüşmek ifade düzey c-Fos ve Dusp1 kanser hücrelerinde apoptotik eşik tanımlamak sonuçlar gösterir.
Onkogen bağımlılığı sürüş genlerin tanımlamak için hem fare – ve CML hasta kaynaklı hücreler (K562) kullanarak deneyler büyüme faktörü ve TKI (imatinib) profil oluşturma birkaç bütün-genom ifade seslendirdi. Bu veri paralel CML hasta veri kümeleriyle CD34 elde edilen analiz edildi+ hematopoietik kök hücre imatinib ile işlemden önce ve sonra. Bu analiz üç gen saptandı (transkripsiyon faktörü [c-Fos], Çift özgüllük fosfataz 1 [Dusp1] ve bir RNA-bağlayıcı protein [Zfp36]) hangi are sık TKI dayanıklı hücrelerdeki upregulated. İlaç direnci veriyor bu genlerin önemi doğrulamak için adım adım vitro ve in vivo analizi yapılır. Bu genlerin ifade düzeyde gerçek zamanlı qPCR (RT-qPCR) ve ilaca dirençli hücrelerde western Blot tarafından teyit edildi. Daha fazla, cDNA overexpression ve c-Fos, Dusp1, shRNA tokalar tarafından nakavt ve Zfp36 yükseltilmiş c-Fos ve Dusp1 ifadeleri yeterli ve TKI direnç danışmam gerekli olduğunu ortaya koymuştur. Bu nedenle, fare modelleri c-Fos ve Dusp1 ile sadece kullanma içinde vivo bir doğrulama işlemi. C-Fos ve Dusp1 genetik doğrulama için biz ROSACreERT indüklenebilir c-Fosfl/fl fareler (koşullu nakavt)14 oluşturulan ve onları ROSACreERT2-c-Fosfl/fl yapmak Dusp1– / – (düz nakavt)15 ile çapraz Dusp1– / – çift transgenik fareler. Kemik iliği türevi c-Seti+ hücreleri (c-Fos üzerindenfl/fl-, Dusp1– / –– ve c-Fosfl/flDusp1– / –) BCR-ABL1 ifade edildi analiz vitro bir koloni oluşturan birim (CFU) tahlil ve içinde Vivo c-Fos ve Dusp1 şartı tek başına veya birlikte lösemi gelişme test etmek için öğrenirim radyasyonlu farelerde kemik iliği nakli tarafından. Aynı şekilde, kimyasal engellemeler BCI tarafından Dusp1 ve c-Fos DFC (difluorinated curcumin)16 (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 test edildi tüp bebek ve içinde vivo BCR-ABL1-ifade, kemik kullanarak vahşi-tipi (WT) fare hücrelerden kemik iliği türevi c-Seti+ . C-Fos ve Dusp1 gereksinim lösemik kök hücre olarak onaylamak için biz nerede BCR-ABL1 özellikle kök hücrelerine doksisiklin (Tet-transactivator ifade fare kök hücre lösemi (SCL) Gen 3′ artırıcı altında tarafından akımıdır CML fare modeli kullanılan Yönetmelik)18,19. Kemik iliği Lin–kullanılan Sca+c-Seti+ (LSK) hücreleri bu fareler içinde vivo nakli tahlil üzerinden. Ayrıca, phopsho-p38 düzeyleri ve Il-6 Dusp1 ve c-Fos inhibisyon, ifade pharmaco dinamik biyolojik olarak sırasıyla kurduk vivo içinde. Son olarak, çalışma insan alaka, hasta kaynaklı CD34 için genişletmek için+ (c-Seti+ hücreleri eşdeğer üzerinden fareler) vardı tabi uzun vadeli için tüp bebek kültür başlatılıyor hücre deneyleri (LTCIC) hücreleri ve bir içinde vivo insanlaşmış fare modeli CML20,21. İmmünyetmezligi fareler CML CD34 + hücre, ardından ilaç tedavisi ve insan lösemik hücre sağkalım analizi ile nakledilen.
Bu projede, biz farklı preklinik modelleri kullanarak hedef tanımlama ve genetik ve kimyasal araçlarını kullanarak doğrulamaları için yöntemler geliştirmek. Bu yöntemler, terapötik geliştirme için kimyasal yöntemleri geliştirme diğer hedefler doğrulamak için başarıyla uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanser hücreleri toplu için TKI tedavi yanıtı Tirozin kinaz oncoprotein sinyalleri tümör bağımlısı olduğu bir abluka tarafından aracılık ettiği. Ancak, nispeten az hakkında nasıl bir azınlık MRD için katkıda bulunan kanser hücrelerinin kaçış onkogen bağımlılığı ve tedavisi4bilinir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda büyüme faktörü sinyal ilaç direnci lösemi ve solid organ tümörler aracılık eder saptandı. Bu çeşitli moleküler mekanizmaları iç diren…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar BaF3 ve WEHI hücreleri sağlamak için G. s. Daley için müteşekkiriz ve T. Reya MSCV-BCR-ABL-IRES-YFP için oluşturur. Yazarlar için-mek şartıyla CML patlama krizden hasta numuneleri M. Carroll için müteşekkiriz. Bu çalışmada ncı (1RO1CA155091), lösemi Araştırma Vakfı ve V Vakfı ve NHLBI (R21HL114074-01) dan M.A. için hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
Referências
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O’Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and “oncogenic shock”. Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes–the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- . Qiagen-miRNAeasy kit Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018)
- . DNA-free DNA removal kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018)
- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
