Métodos para evaluar el papel de c-Fos y Dusp1 en dependencia del oncogén
Summary
Aquí, describimos protocolos de validación genética y química de c-Fos y Dusp1 como una diana farmacológica en leucemia usando modelos de ratón humanizado y genética in vitro e in vivo. Este método puede ser aplicado a cualquier objetivo de validación genética y desarrollo terapéutico.
Abstract
La demostración de inhibidores de la cinasa de la tirosina (ITC) en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (LMC) ha anunciado una nueva era en la terapéutica del cáncer. Sin embargo, una pequeña población de células no responden al tratamiento de TKI, dando por resultado la enfermedad residual mínima (Milirutherford); incluso los más potentes ITC no erradicar estas células. Estas células MRD sirven como reservorio para el desarrollo de resistencia a la terapia. No se sabe por qué tratamiento TKI es ineficaz contra las células de la MRD. Señalización del factor de crecimiento está implicado en el apoyo a la supervivencia de las células de la MRD durante el tratamiento de TKI, pero carece de una comprensión mecanicista. Estudios recientes demostraron que una elevada de c-Fos y expresión de Dusp1 como resultado convergente oncogénico y factor de crecimiento en las células de la MRD median resistencia TKI. La inhibición genética y química de c-Fos y Dusp1 hace CML exquisitamente sensible a la ITC y cura la leucemia mielógena crónica en ambos modelos de ratón humanizado y genética. Se identificaron estos genes diana mediante microarrays múltiples de TKI-sensible y – células resistentes. Aquí, ofrecemos métodos para la validación de la blanco usando modelos de ratón in vitro e in vivo. Estos métodos pueden aplicarse fácilmente a cualquier destino para validación genética y desarrollo terapéutico.
Introduction
Actividad de la cinasa de tirosina constitutiva del oncogene de fusión BCR-ABL1 causa CML, que proporciona un fundamento para orientar la actividad quinasa por inhibidores de molécula pequeña. El éxito de ITC en el tratamiento de pacientes con LMC revolucionó el concepto de terapia dirigida1,2. Posteriormente, la terapia anti-cinasa como medicina de precisión fue desarrollada para varias otras malignidades, incluyendo tumores sólidos. Hasta ahora, más de treinta los inhibidores de la quinasa han sido aprobados por la FDA de Estado Unidos para el tratamiento de diversos tumores malignos. Tratamiento de TKI es muy eficaz en la supresión de la enfermedad, no es curativa. Además, persiste una población pequeña de células de cáncer durante el tratamiento: la MRD3,4,5. Incluso los pacientes que mostraron remisión completa quedan con MRD, que eventualmente suprimidos resultados en recaída si no continuamente. Por lo tanto, la erradicación de las células MRD es necesario para lograr una respuesta durable o curativa. CML representa un valioso paradigma para definir el concepto de la medicina de precisión, mecanismos de oncogénesis, rational therapeutics dirigido por el destino, progresión de la enfermedad y resistencia a los medicamentos. Sin embargo, aún hoy, el mecanismo de muerte celular inducida por TKI de conducción en las células cancerosas no se entiende completamente, ni por qué las células MRD (formadas por células leucémicas [LSCs]) son intrínsecamente resistentes a ITC4,6. Sin embargo, el fenómeno de la «dependencia oncogene» a quinasa mutante oncoproteína está implicado en la eficacia TKI donde la inhibición aguda de oncogén dirigida por ITC causa un choque oncogénico que conduce a una respuesta masiva proapoptóticas o quietud en celda manera dependiente del contexto6,7,8,9. Sin embargo, carece de la base mecanicista de la dependencia del oncogene. Estudios recientes han implicado que el factor de crecimiento señalización abroga dependencia oncogene y por lo tanto confiere resistencia a TKI terapia10,11,12. Por lo tanto, para ganar la penetración en el mecanismo de la dependencia del oncogene, realizamos perfiles de expresión de todo el genoma de BCR-ABL1 adicto y células infecciosa (crecidas con factores de crecimiento), que reveló que el c-Fos y Dusp1 son importantes mediadores de la de adicción oncogén13. La canceladura genética de c-Fos y Dusp1 es células letales BCR-ABL1-expresión sintéticas y los ratones utilizados en el experimento no se desarrolló leucemia. Por otra parte, la inhibición de c-Fos y DUSP1 por inhibidores de molécula pequeña había curada LMC BCR-ABL1-inducida en ratones. Los resultados muestran que los niveles de expresión de c-Fos y Dusp1 definen el umbral de la apoptosis en las células cancerosas, que niveles más bajos confieren sensibilidad de drogas mientras que niveles superiores causan resistencia a la terapia13.
Para identificar los genes conduce a la dependencia del oncogene, realizamos la expresión de todo el genoma varios perfiles experimentos en presencia de factor de crecimiento y un TKI (imatinib) usando ratón y células derivadas del paciente de leucemia mielógena crónica (K562). Estos datos fueron analizados en paralelo con conjuntos de datos paciente de CML de CD34+ las células madre hematopoyéticas antes y después del tratamiento con imatinib. Este análisis reveló tres genes (un factor de transcripción [c-Fos], fosfatasa de especificidad dual 1 [Dusp1] y una proteína de unión a RNA [Zfp36]) que comúnmente son upregulated en las células resistentes a TKI. Para validar la importancia de estos genes que confieren resistencia a los medicamentos, llevamos a cabo análisis in vitro e in vivo paso a paso. Los niveles de expresión de estos genes fueron confirmados por qPCR en tiempo real (RT-qPCR) y western blot en células resistentes a los medicamentos. Además, la sobreexpresión de cDNA y caída por shRNA horquillas de c-Fos, Dusp1, y Zfp36 reveló que elevados de c-Fos y expresiones Dusp1 son suficientes y necesarias para conferir resistencia a TKI. Por lo tanto, se realizó una validación in vivo con modelos de ratón c-Fos y Dusp1 solamente. Para la validación genética del c-Fos y Dusp1, hemos creado ROSACreERT inducible de c-Fosfl/fl ratones (condicional knockout)14 y cruzó con Dusp1– / – (eliminatorias recta)15 para hacer ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1– / – ratones transgénicos doble. Las células de la médula ósea c-Kit+ (de c-Fosfl/fl-, Dusp1– / –– y c-Fosfl/flDusp1– / –) expresan BCR-ABL1 fueron analizados en vitro en una prueba de unidad (UFC) formadoras de colonias y en vivo por el trasplante de médula ósea en ratones irradiados letalmente, a probar el requisito de c-Fos y Dusp1 solos o juntos en el desarrollo de leucemia. Asimismo, las inhibiciones químicas de c-Fos por DFC (difluorados curcumina)16 y Dusp1 por BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 fueron probados in vitro e in vivo utilizando BCR-ABL1-expresando, hueso células derivadas de la médula c-Kit+ del ratón de tipo salvaje (WT). Para confirmar la exigencia de c-Fos y Dusp1 en células leucémicas, se utilizó un modelo de ratón de LMC donde BCR-ABL1 específicamente fue inducida en las células de sus madre por doxiciclina (expresa Tet transactivator bajo células murino leucemia (SCL) gen 3′ potenciador Reglamento)18,19. Utiliza la médula ósea Lin–c-Kit de Sca++ (LSK) las células de estos ratones en un ensayo de trasplante in vivo. Además, establecimos los niveles de phopsho-p38 y la expresión de IL-6 como biomarcadores de fármaco-dinámico para Dusp1 y la inhibición de c-Fos, respectivamente, en vivo. Por último, ampliar el estudio de relevancia humana, derivados del paciente CD34+ las células (equivalente a las células c-Kit+ de los ratones) fueron sometidas a largo plazo ensayos in vitro inicio de cultivo celular (LTCIC) y un modelo de ratón humanizado en vivo de CML20,21. Los ratones inmunodeficientes fueron trasplantados con células de CML CD34 +, seguidas de tratamiento y análisis de la supervivencia de células leucémicas humanas.
En este proyecto, desarrollamos métodos para la identificación de objetivos y validaciones usando herramientas genéticas y químicas, utilizando diferentes modelos preclínicos. Estos métodos pueden aplicarse con éxito para validar otros objetivos desarrollar modalidades de química para el desarrollo terapéutico.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mayor parte de las células cancerosas, la respuesta terapéutica a TKI es mediada por un bloqueo de las señales de la tirosina-cinasa-oncoprotein a que el tumor es adicto. Sin embargo, relativamente poco se sabe sobre cómo una minoría de las células de cáncer que contribuyen a la MRD escape oncogene en dependencia y la terapia4. Estudios recientes revelaron que de señalización del factor de crecimiento media resistencia a droga en leucemia y tumores de órganos sólidos. Esto sugiere qu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están agradecidos a G. Q. Daley por proporcionar las células BaF3 y WEHI y construye T. Reya para MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP. Los autores están agradecidos a M. Carroll para proporcionar las muestras pacientes de la crisis de la ráfaga CML. Este estudio fue apoyado por subvenciones a M.A. de NCI (1RO1CA155091), la Fundación de investigación de la leucemia y la Fundación de la V y de NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
Referências
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- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
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