Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법
Summary
여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델을 사용 하 여 백혈병에서 마약 대상으로 c Fos와 Dusp1의 유전과 화학 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 유전 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.
Abstract
만성 골수성 백혈병 (CML) 치료에 tyrosine kinase 억제제 (TKIs)의 데모는 암 치료에 새로운 시대를 예 고 했다. 그러나, 세포의 작은 인구에 반응 하지 않는 TKI 치료 결과 최소 잔여 질병 (MRD); 이 세포를 근절 하기 위해 심지어는 가장 강력한 TKIs 실패. 이러한 MRD 세포 치료에 저항을 개발 하는 저수지 역할을 합니다. 왜 TKI 치료 MRD 셀에 대 한 효과 알 수 없습니다. TKI 치료 동안 MRD 세포의 생존을 지 원하는에 연루는 성장 인자 신호 하지만 기계적 이해 부족. 최근 연구는 높은 c-Fos와 Dusp1 집중 결과로 종양 표현과 MRD 셀에 신호 하는 성장 인자 중재 TKI 저항을 설명 했다. C-Fos와 Dusp1의 유전과 화학 억제 CML를 TKIs에 절 묘하게 과민 한 렌더링 하 고 두 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델에 CML을 치료. 우리는 TKI-민감하고-내성 세포에서 여러 microarrays를 사용 하 여이 대상 유전자 발견. 여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 마우스 모델을 사용 하 여 대상 유효성 검사 메서드를 제공 합니다. 이러한 메서드는 쉽게 유전자 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.
Introduction
BCR-ABL1 퓨전 oncogene의 제정 티로신 키 니 아 제 활동 하면 CML, 작은 분자 억제제 여 키 니 아 제 활동에 근거를 제공 한다. CML 환자 치료에 TKIs의 성공 타겟된 치료1,2의 개념을 혁명. 그 후, 안티 니 정밀 의학으로 치료는 단단한 종양을 포함 한 다른 여러 악성 종양에 대 한 개발 되었다. 지금까지, 30 개 이상의 kinase 억제제는 다양 한 악성 종양 치료를 위한 미국 국가 FDA에 의해 승인 되었습니다. TKI 치료 질병 억제에 매우 효과적 이다, 그러나 그것은 치료입니다. 게다가, 암 세포의 작은 인구는 치료 기간 동안 지속: MRD3,,45. 완전 한 사 함을 보여도 환자가 결국 결과에 재발 하지 않을 경우 지속적으로 억제 MRD 남아 있습니다. 그러므로, MRD 세포의 박멸 내구성 또는 치료 응답을 달성 하기 위해 필요 합니다. CML은 발암, 합리적인 대상 감독 치료제, 질병의 진행, 그리고 약물 저항 메커니즘, 정밀 의학의 개념을 정의 하기 위한 귀중 한 패러다임을 나타냅니다. 그러나, 오늘날에 암 세포에 TKI 유도 된 세포 죽음을 운전 하는 메커니즘은 완전히 이해 되지 않습니다,도 왜 MRD 세포 (leukemic 줄기 세포 [LSCs]의 구성)은 본질적으로 TKIs4,6. 그럼에도 불구 하 고, 돌연변이 니 oncoprotein 하 “oncogene 의존”의 현상 TKIs에 의해 타겟된 oncogene의 심각한 저해 대규모 proapoptotic 응답 또는 셀에 정지에 이르게 하는 종양 충격을 발생 하는 TKI 효능에 연루는 맞는 방식으로6,7,,89. 그러나, oncogene 의존의 기계적 underpinning 부족 이다. 최근 연구는 주석은 oncogene 의존 성장 인자 신호 및 따라서 TKI 치료10,,1112에 저항을 수 여 연루 있다. 따라서, oncogene 의존의 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻기 위해 우리가 수행 전체-게놈 식 중독 BCR-ABL1 및 nonaddicted 세포 성장 인자 (성장), c-Fos와 Dusp1의 중요 한 중개자는 밝혔다에서 프로 파일링 oncogene 중독13. C-Fos와 Dusp1의 유전 삭제 합성 BCR ABL1 표현 하는 치명적인 셀 이며 실험에 사용 하는 생쥐 백혈병을 개발 하지 않았다. 또한, 작은 분자 억제제에 의해 c-Fos와 DUSP1의 억제 생쥐에서 BCR ABL1 유도 CML 치료. 결과 높은 수준의 치료13저항을 야기 하는 동안 낮은 수준의 마약 감도 부여 c Fos와 Dusp1의 식 수준 암 세포, apoptotic 임계값 정의 보여 줍니다.
Oncogene 의존을 운전 하는 유전자를 식별 하기 위해 우리는 마우스-그리고 CML 환자 파생 셀 (K562)를 사용 하 여 성장 인자와 TKI (imatinib)의 실험을 프로 파일링 하는 여러 전체 게놈 식 수행. 이러한 데이터는 CD34에서 얻은 CML 환자 데이터 세트와 병렬로 분석 되었다+ 조 혈 줄기 세포 imatinib 치료 전후. 이 분석 공개 3 개의 유전자 (전사 요소 [c-Fos], 이중 특이성 인산 가수분해 효소 1 [Dusp1], 그리고 RNA 의무적인 단백질 [Zfp36])는 일반적으로 upregulated TKI 내성 세포에서. 약물 저항을 부여에 있는이 유전자의 중요성을 확인 하기 위해 우리는 단계별 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실시. 이 유전자의 표현 수준 실시간 정량 (RT-정량)와 서 부 럽 약물 내성 세포에 의해 확인 되었다. 또한, cDNA overexpression 및 c-Fos, Dusp1의 shRNA 헤어핀으로 최저 그리고 Zfp36 높은 c-Fos와 Dusp1 식은 충분 하 고 TKI 저항을 부여 하는 데 필요한. 따라서, 우리는 c-Fos와 Dusp1 모델 마우스를 사용 하 여 생체 조건 유효성 검사를 수행. C-Fos와 Dusp1의 유전 유효성 검사에 대 한 우리 ROSACreERT를 유도할 수 있는 c-Fosfl/플로리다 쥐 (조건부 녹아웃)14 만들어지고 Dusp1-/- (똑 바른 녹아웃)15 ROSACreERT2-c-Fosfl/플로리다 수 있도록 그들을 넘어 Dusp1/- 이중 유전자 변형 쥐. 골 수 파생 된 c-키트+ 세포 (c Fos에서fl/플로리다-, Dusp1-/--, c-Fosfl/플로리다Dusp1-/-) BCR ABL1 표현 했다 분석 생체 외에서 에 콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 결과, vivo 백혈병 개발에 혼자 또는 함께 c-Fos와 Dusp1의 요구를 테스트 하려면 치명적 방사능된 쥐에서 골 수 이식에 의해. 마찬가지로, DFC (difluorinated curcumin)16 c-Fos와 BCI에 의해 Dusp1의 화학 임무 (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 시험 되었다 생체 외에서 그리고 vivo BCR-ABL1-표현, 뼈를 사용 하 여에서 야생-타입 (WT) 마우스에서 골 수 유래 c-키트+ 세포. 우리 어디 BCR ABL1 특히 유도 되었다 그것의 줄기 세포에 doxycycline (Tet transactivator 표현 murine 줄기 세포 백혈병 (SCL) 유전자 3′ 증강에 의해 CML 마우스 모델을 활용 하는 leukemic 줄기 세포에서 c-Fos와 Dusp1의 요구를 확인 하려면 레 귤 레이 션)18,19. 우리 골 린–사용 Sca+c-키트+ (LSK) 세포 vivo에서 이식 분석 결과에서 이러한 쥐에서. 또한, 우리는 설립 phopsho-p38 수준 및 Dusp1 및 c-Fos 저해 수립이 동적 생체로 일리노이-6의 식 각각, vivo에서. 마지막으로, 인간의 관련성, CD34 환자 파생에 대 한 연구를 확장+ 세포 (마우스에서 c-키트+ 세포에 해당) 복종된 장기 생체 외에서 문화 시작 셀 분석 실험 (LTCIC)를 했다 vivo에서 인간 답게 마우스 모델의 CML20,21. Immunodeficient 마우스 CML CD34 + 세포, 약물 치료 및 인간 leukemic 세포 생존의 분석으로 이식 했다.
이 프로젝트에서 우리는 다른 전 임상 모델을 사용 하 여 대상 식별 및 유전과 화학 도구를 사용 하 여 유효성 검사에 대 한 방법을 개발 한다. 이러한 메서드는 치료 개발에 대 한 화학 modalities를 개발 하는 다른 대상 유효성을 성공적으로 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
암 세포의 대량에 대 한 치료 응답 TKI은 티로신 키 니 아 제 oncoprotein 신호는 종양은 중독의 봉쇄에 의해 중재 됩니다. 그러나, 상대적으로 작은 MRD에 기여 하는 암 세포의 소수 oncogene 의존과 치료4를 탈출 하는 방법에 대 한 알려져 있다. 최근 연구는 백혈병에 단단한 기관 종양 약물 저항을 중재 성장 인자 신호 밝혀. 이 다양 한 분자 메커니즘 본질적인 저항10<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 BaF3 및 WEHI 세포를 제공 하기 위한 G. Q. 데일리 감사 이며 T. Reya MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP에 대 한 구성. 저자는 M. 캐롤 감사 CML 폭발 위기에서 환자 샘플을 제공 합니다. 이 연구 NCI (1RO1CA155091), 백혈병 연구 재단 및 V 재단, 그리고 NHLBI (R21HL114074-01)에서 석사를 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
Referências
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- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
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