Metoder til evaluering af c-Fos rolle og Dusp1 i onkogen afhængighed
Summary
Her beskriver vi protokoller for genetiske og kemiske validering af c-Fos og Dusp1 som en drug target i leukæmi ved hjælp af in vitro- og in vivo genetiske og humaniseret musemodeller. Denne metode kan anvendes på ethvert mål for genetiske validering og terapeutisk udvikling.
Abstract
Demonstration af tyrosin kinase hæmmere (TKIs) til behandling af kronisk myeloid leukæmi (CML) har indvarslet en ny æra i kræft therapeutics. Men en lille population af celler ikke reagerer på TKI behandling, hvilket resulterer i minimal residual sygdom (MRD); selv de mest potente TKIs undlader at udrydde disse celler. Disse MRD celler fungerer som et reservoir til at udvikle resistens over for behandling. Hvorfor TKI behandling er ineffektive mod MRD celler er ikke kendt. Vækstfaktor signalering er impliceret i støtte MRD celler kan overleve under TKI behandling, men en mekanistisk forståelse, der mangler. Nylige undersøgelser viste, at et forhøjet c-Fos og Dusp1 udtryk som følge af konvergerende mutationer og vækstfaktor signalering i MRD celler mægle TKI modstand. Den genetiske og kemiske hæmning af c-Fos og Dusp1 gengiver CML udsøgt følsomme over for TKIs og hærder CML i både genetiske og humaniseret musemodeller. Vi identificeret disse mål gener ved hjælp af flere microarrays fra TKI-følsomme og -resistente celler. Her, leverer vi metoder til target validering ved hjælp af in vitro- og in vivo musemodeller. Disse metoder kan nemt anvendes på enhver mål for genetiske validering og terapeutisk udvikling.
Introduction
Konstituerende tyrosin kinase aktivitet i BCR-ABL1 fusion onkogen forårsager CML, som giver et rationale for at målrette kinase aktivitet af lille molekyle hæmmere. TKIs succes i behandling af CML patienter revolutioneret begrebet målrettet behandling1,2. Efterfølgende, anti-kinase terapi som præcision medicin blev udviklet for flere andre maligniteter, herunder solide tumorer. Indtil videre er er mere end tredive kinase hæmmere blevet godkendt af United State FDA til behandling af forskellige maligniteter. Mens TKI behandling er meget effektiv til at undertrykke sygdommen, er det ikke helbredende. Desuden en lille population af kræftceller fortsætter under behandling: MRD3,4,5. Selv patienter, der viste komplet remission er tilbage med MRD, som til sidst resultater i tilbagefald, hvis ikke løbende undertrykt. Derfor, udryddelse af MRD celler er nødvendige for at opnå en holdbar eller helbredende reaktion. CML repræsenterer en værdifuld paradigme for at definere begrebet præcision medicin, oncogenesis og rationelle mål-rettet therapeutics, sygdomsprogression og resistens over for lægemidler. Men selv i dag, mekanisme kørsel TKI-induceret celledød i cancerceller er ikke fuldt forstået, eller hvorfor MRD celler (består af leukemic stamceller [LSCs]) er uløseligt resistente over for TKIs4,6. Ikke desto mindre er fænomenet “onkogen afhængighed” til mutant kinase oncoprotein impliceret i TKI effekten hvor akut hæmning af målrettede onkogen af TKIs forårsager en muterede chok, der fører til en massiv proapoptotic svar eller ubevægelighed i celle kontekst-afhængige måde6,7,8,9. Men den mekanistiske understøttelse af onkogen afhængighed mangler. Nylige undersøgelser har impliceret at vækstfaktor signalering ophæver onkogen afhængighed og dermed giver resistens over for TKI terapi10,11,12. Derfor, for at få indsigt i mekanismen af onkogen afhængighed, vi udførte hele-genom udtryk profilering fra BCR-ABL1 afhængige og nonaddicted celler (vokset med vækstfaktorer), som viste, at c-Fos og Dusp1 er vigtige formidlere af onkogen afhængighed13. Den genetiske sletning af c-Fos og Dusp1 er syntetiske dødelige at BCR-ABL1-udtrykker celler og mus bruges i eksperimentet udvikle ikke leukæmi. Derudover helbredt hæmning af c-Fos og DUSP1 af lille molekyle hæmmere BCR-ABL1-induceret CML i mus. Resultaterne viser, at udtrykket niveauer af c-Fos og Dusp1 definerer den apoptotiske tærskel i kræftceller, således at lavere niveauer giver drug følsomhed, mens højere niveauer forårsage resistens over for terapi13.
For at identificere de gener kørsel onkogen afhængighed, udført vi flere hele-genom udtryk profilering eksperimenter vækst faktor og en TKI (imatinib) ved hjælp af både mus- og CML patient-afledte celler (K562). Disse data blev analyseret parallelt med CML patient datasæt fra CD34+ hæmatopoietisk stamceller før og efter behandling med imatinib. Denne analyse viste tre gener (en transkriptionsfaktor [c-Fos], dobbelt specificitet fosfatase 1 [Dusp1], og et RNA-bindende protein [Zfp36]) er almindeligt upregulated i TKI-resistente celler. For at validere betydningen af disse gener i giver resistens over for lægemidler, foretog vi en trinvis i in vitro og i vivo analyse. Udtrykket niveauer af disse gener er blevet bekræftet af real-time qPCR (RT-qPCR) og western blotting i resistente celler. Yderligere, cDNA overekspression og knockdown af shRNA Hårnåle af c-Fos, Dusp1, og Zfp36 viste, at forhøjet c-Fos og Dusp1 udtryk er tilstrækkeligt og nødvendigt at overdrage TKI modstand. Derfor, vi udføres en in vivo validering ved hjælp af musen modeller med c-Fos og Dusp1 kun. For genetiske validering af c-Fos og Dusp1, vi skabt ROSACreERT-inducerbar c-Fosfl/fl mus (betinget knockout)14 og krydsede dem med Dusp1– / – (lige knockout)15 at gøre ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1– / – dobbelt-Transgene mus. Knoglemarv-afledte c-Kit+ celler (fra c-Fosfl/fl-, Dusp1– / –-, og c-Fosfl/flDusp1– / –) udtrykker BCR-ABL1 blev analyseret i vitro i en kolonidannende enhed (CFU) analyse, og i vivo af knoglemarvstransplantation i lethally bestrålede mus, at teste kravet om c-Fos og Dusp1 alene eller sammen i udvikling af leukæmi. Ligeledes, de kemiske hæmninger af c-Fos af DFC (difluorinated curcumin)16 og Dusp1 af BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 blev testet in vitro- og in vivo, ved hjælp af BCR-ABL1-udtrykker, knogle marv-afledte c-Kit+ celler fra wild-type (WT) mus. For at bekræfte kravet om c-Fos og Dusp1 i leukemic stamceller, udnyttede vi en CML musen model hvor BCR-ABL1 var specielt induceret i sin stamceller af doxycyclin (Tet-transaktivatoren udtrykker under murine stem cell leukæmi (SCL) gen 3′ enhancer forordning)18,19. Vi brugte knoglemarv Lin–Sca+c-Kit+ (LSK) celler fra disse mus i en in vivo transplantation assay. Desuden, vi etableret phopsho-p38 niveauer og udtryk af IL-6 som farmakodynamiske biomarkører for Dusp1 og c-Fos hæmning, henholdsvis, i vivo. Endelig, for at udvide undersøgelsen for menneskelige relevans, patient-afledte CD34+ celler (svarende til c-Kit+ celler fra mus) blev underkastet en langsigtet in vitro-kultur-indlede celle assays (LTCIC) og en in vivo humaniseret musemodel af CML20,21. Immundefekte musene blev transplanteret med CML CD34 + celler, efterfulgt af behandling og analyse af menneskers leukemic celle overlevelse.
I dette projekt udvikler vi metoder til målet identifikation og validering ved hjælp af både genetiske og kemiske værktøjer, ved hjælp af forskellige prækliniske modeller. Disse metoder kan anvendes med succes for at validere andre mål udvikle kemiske modaliteter for terapeutisk udvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
For hovedparten af kræftceller, er den terapeutiske svar TKI medieret af en blokade af tyrosin-kinase-oncoprotein signaler som tumor er afhængige af. Imidlertid er relativt lidt kendt om hvordan et mindretal af kræftceller bidrager til MRD undslippe onkogen afhængighed og terapi4. Nylige undersøgelser afslørede, at vækstfaktor signalering medierer resistens i både leukæmi og solid orgel tumorer. Dette tyder på, at forskellige molekylære mekanismer kan ligge til grund for iboende modstan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er taknemmelige at G. Q. Daley for at levere BaF3 og WEHI cellerne og T. Reya for MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP konstruktioner. Forfatterne er taknemmelige at M. Carroll for at levere patientprøver fra CML blast krise. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud til M.A. fra NCI (1RO1CA155091), leukæmi Research Foundation og V Foundation og fra NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
Referências
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O’Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and “oncogenic shock”. Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes–the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- . Qiagen-miRNAeasy kit Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018)
- . DNA-free DNA removal kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018)
- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
