Méthodes permettant d’évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance de l’oncogène
Summary
Nous décrivons ici les protocoles de validation chimique et génétique de c-Fos et Dusp1 comme cible de drogue dans la leucémie à l’aide de modèles de souris in vitro et in vivo de génétique et humanisé. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle cible pour la validation génétique et développement thérapeutique.
Abstract
La démonstration des inhibiteurs de tyrosine kinase (utilisation) dans le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) a annoncé une nouvelle ère dans la thérapeutique anticancéreuse. Cependant, une petite population de cellules ne répond pas au traitement TKI, entraînant la maladie résiduelle minime (MRD) ; même les plus puissants inhibiteurs fail pour éradiquer ces cellules. Ces cellules MRD servent de réservoir à développer une résistance au traitement. Pourquoi le traitement TKI est inefficace contre les cellules MRD ne connaît pas. Signalisation du facteur de croissance est impliquée dans le soutien à la survie des cellules MRD durant le traitement TKI, mais une interprétation mécaniste fait défaut. Des études récentes ont démontré qu’un élevé de c-Fos et d’expression Dusp1 par suite convergente oncogène et facteur de croissance de signalisation dans les cellules MRD médient résistance TKI. L’inhibition génétique et chimique de c-Fos et Dusp1 rend CML extraordinairement sensible aux inhibiteurs et durcit CML dans les deux modèles de souris génétiques et humanisé. Nous avons identifié ces gènes cibles à l’aide de puces multiples des cellules résistantes et – TKI sensibles. Ici, nous fournissent des méthodes pour la validation de cibles à l’aide de modèles de souris in vitro et in vivo. Ces méthodes peuvent facilement être appliquées à n’importe quelle cible pour la validation génétique et développement thérapeutique.
Introduction
L’activité kinase tyrosine constitutive des oncogènes de fusion BCR-ABL1 provoque CML, qui fournit une justification pour cibler l’activité kinasique de petites molécules inhibitrices. Le succès de l’utilisation dans le traitement des patients atteints de LMC a révolutionné le concept de thérapie ciblée1,2. Par la suite, la thérapie Anti-kinase comme médicament de précision a été développée pour plusieurs autres tumeurs malignes, y compris les tumeurs solides. Jusqu’à présent, plus de trente inhibiteurs de kinase ont été approuvés par la FDA des État Unis pour le traitement de diverses tumeurs malignes. Alors que le traitement TKI est très efficace pour supprimer la maladie, il n’est pas curatif. En outre, une petite population de cellules cancéreuses persiste pendant le traitement : le MRD3,4,5. Même les patients qui ont montré la rémission complète sont retrouvent avec MRD, qui finalement réprimées les résultats en rechute, sinon en permanence. Par conséquent, l’élimination des cellules MRD est nécessaire pour atteindre une réponse durable ou curative. LMC représente un paradigme précieux pour définir le concept de la médecine de précision, les mécanismes de l’oncogenèse, rationnelle axée sur les cibles thérapeutiques, progression de la maladie et la résistance aux médicaments. Cependant, aujourd’hui encore, le mécanisme de mort cellulaire induite par TKI au volant dans les cellules cancéreuses n’est pas entièrement compris, ni pourquoi les cellules MRD (composées de cellules souches leucémiques [CDL]) sont intrinsèquement résistants à cette4,6. Néanmoins, le phénomène de la « dépendance oncogène » à mutant kinase oncoprotéine est impliqué dans efficacité TKI où l’inhibition aiguë de l’oncogène ciblé par cette provoque un choc oncogène qui entraîne une réponse massive proapoptotique ou quiescence dans la cellule manière contextuelle6,7,8,9. Toutefois, le fondement mécaniste de la dépendance de l’oncogène est absent. Des études récentes ont mis en cause que la signalisation du facteur de croissance abroge la dépendance de l’oncogène et par conséquent confère une résistance aux TKI thérapie10,11,12. Par conséquent, pour mieux comprendre le mécanisme de la dépendance de l’oncogène, nous avons effectué profilage de l’expression du génome entier de BCR-ABL1 accro et des cellules nonaddicted (cultivées présentant des facteurs de croissance), qui a révélé que le c-Fos et Dusp1 sont des médiateurs critiques de oncogène addiction13. La délétion génétique de c-Fos et Dusp1 est cellules létales permettant d’exprimer par le BCR-ABL1 synthétiques et les souris utilisées pour l’expérience n’a pas développé une leucémie. De plus, l’inhibition de c-Fos et DUSP1 de petites molécules inhibitrices guéri induite par la BCR-ABL1 LMC chez la souris. Les résultats montrent que les niveaux d’expression de c-Fos et Dusp1 définissent le seuil de l’apoptose dans les cellules cancéreuses, tels que des niveaux inférieurs confèrent sensibilité aux médicaments, alors que des niveaux plus élevés causent la résistance à la thérapie de13.
Pour identifier les gènes de la dépendance de l’oncogène de conduite, nous avons effectué plusieurs profilage des expériences en présence de facteur de croissance et d’un TKI (imatinib) à l’aide de la souris – et cellules d’origine patient LMC (K562) de l’expression du génome entier. Ces données ont été analysées en parallèle aux ensembles de données patients LMC, obtenu à partir de CD34+ des cellules souches hématopoïétiques avant et après traitement par l’imatinib. Cette analyse a révélé trois gènes (un facteur de transcription [c-Fos], la double spécificité phosphatase 1 [Dusp1] et une protéine de liaison à l’ARN [Zfp36]) qui sont couramment positivement en cellules TKI-résistantes. Pour valider l’importance de ces gènes conférant une résistance aux médicaments, nous avons effectué des analyses in vitro et in vivo étape par étape. Les niveaux d’expression de ces gènes ont été confirmés par qPCR en temps réel (RT-qPCR) et western blot dans les cellules résistantes aux médicaments. En outre, la surexpression de cDNA et knockdown de Sharn barettes de c-Fos, Dusp1, et Zfp36 a révélé qu’élevés de c-Fos et Dusp1 des expressions sont suffisantes et nécessaires pour conférer résistance TKI. Par conséquent, nous avons effectué une validation in vivo à l’aide de modèles murins avec c-Fos et Dusp1 seulement. Pour la validation génétique de c-Fos et Dusp1, nous avons créé inductibles par ROSACreERT de souris (conditionnel knockout) c-Fosfl/fl 14 et les croisées avec Dusp1– / – (droite knockout)15 à faire ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1– / – souris double-transgéniques. Les cellules de moelle osseuse c-Kit+ (de c-Fosfl/fl-, Dusp1– / –– et c-Fosfl/flDusp1– / –) exprimant BCR-ABL1 étaient analysées in vitro dans un test d’unité (CFU) formatrices et en Vivo par greffe de moelle osseuse chez des souris mortellement irradiés, pour tester la condition c-Fos et Dusp1 seul ou ensemble dans le développement de la leucémie. De même, les inhibitions chimiques de c-Fos par DFC (difluoré curcumine)16 et Dusp1 par BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one),17 ont été testés in vitro et in vivo par BCR-ABL1-exprimant, OS cellules de moelle osseuse c-Kit+ par la type sauvage (WT) de souris. Pour confirmer l’obligation de c-Fos et Dusp1 dans les cellules souches leucémiques, nous avons utilisé un modèle de souris de LMC où BCR-ABL1 a été spécifiquement induits dans ses cellules souches par doxycycline (Tet-transactivateur se déclare dans les cellules souches murines leucémie (SCL) gène 3′ enhancer règlement)18,19. Nous avons utilisé la moelle osseuse Lin–c-Kit de Sca++ (LSK) les cellules de ces souris lors d’un essai in vivo de transplantation. En outre, nous avons établi les niveaux phopsho-p38 et l’expression d’IL-6 comme biomarqueurs pharmaco-dynamique pour Dusp1 et inhibition de c-Fos, respectivement, in vivo. Enfin, d’élargir l’étude humaine pertinence, dérivé de patient CD34+ cellules (équivalent pour les cellules de c-Kit+ de souris) ont été soumis à long terme essais in vitro qui lance la culture cellulaire (LTCIC) et un modèle de souris humanisée in vivo des CML20,21. Les souris immunodéficientes ont été transplantées avec LMC CD34 + cellules, suivies du traitement de la toxicomanie et l’analyse de la survie des cellules leucémiques humaines.
Dans ce projet, nous développons des méthodes d’identification des cibles et des validations à l’aide d’outils génétiques et chimiques, à l’aide de différents modèles précliniques. Ces méthodes peuvent être appliquées avec succès afin de valider les autres objectifs de développement chimiques modalités de développement thérapeutique.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plus grande partie des cellules cancéreuses, la réponse thérapeutique au TKI est médiée par un blocus de tyrosine-kinase-oncoprotéine signaux dont la tumeur est accro. Cependant, relativement peu est connu sur une minorité de cellules cancéreuses contribuant au MRD comment échapper à la dépendance et la thérapie d’oncogène4. Des études récentes ont révélé que la signalisation du facteur de croissance Médie pharmacorésistance dans la leucémie et de tumeurs des organes plei…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants à G. Q. Daley pour fournir les cellules BaF3 et WEHI et T. Reya pour la MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP construit. Les auteurs sont reconnaissants à M. Carroll pour fournir les échantillons de patients de la crise blastique CML. Cette étude a été financée par des dons à M.A. de la NCI (1RO1CA155091), la Leukemia Research Foundation et la fondation de V et du NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
Referências
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- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
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