C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法
Summary
ここでは、in vitro および in vivo 遺伝子とヒト化マウスモデルを使用して白血病の薬剤標的として C-fos と Dusp1 の遺伝的・化学的検証のためのプロトコルについて述べる。このメソッドは、遺伝学的検証、および治療開発を対象に適用できます。
Abstract
慢性骨髄性白血病 (CML) 治療におけるチロシン キナーゼ阻害剤 (こ) のデモンストレーションが癌治療の新しい時代を告げた。ただし、セルの小さい人口に応答しません TKI 治療結果微小残存病変 (MRD);これらの細胞を根絶するためにも、最も強力なず失敗。これらの MRD の細胞は、治療への抵抗を開発するための貯水池として機能します。TKI 治療なん MRD のセルに対して有効であることは知られていません。TKI 治療中に MRD 細胞の生存を支える成長因子シグナリング、関与しているが、機構の理解が欠けています。最近の研究では、昇格した C-fos と Dusp1 式収束結果発癌性成長因子 MRD 細胞内シグナルが TKI 抵抗を仲介することを示した。C-fos と Dusp1 の遺伝的・化学的抑制は、こに絶妙に敏感 CML をレンダリングし、遺伝とヒト化マウスモデルの慢性骨髄性白血病の治療法します。TKI 感受性及び抵抗性細胞から複数のマイクロ アレイを使用してこれらのターゲット遺伝子を同定しました。ここでは、in vitro および in vivo マウスモデルを使用してターゲットの検証のためのメソッドを提供します。これらのメソッドは、遺伝学的検証、および治療開発を対象に簡単に適用できます。
Introduction
BCR ABL1 融合遺伝子の構成のチロシンキナーゼの活性を引き起こす慢性骨髄性白血病、小分子阻害剤によってキナーゼ活動を対象とする理論的根拠を提供します。この慢性骨髄性白血病患者の治療の成功は、標的療法1,2の概念を革命化しました。その後、いくつかなどの悪性腫瘍、固形腫瘍の精密薬として抗プロテインキナーゼ治療が開発されました。ところ、30 以上のキナーゼ阻害剤は、様々 な悪性腫瘍の治療のため米国状態 FDA によって承認されています。TKI 治療は病気の抑制に非常に効果的ですが、根治的ではありません。その上、癌細胞の小集団が治療中に続く: MRD3,4,5。完全寛解を示したもの患者は最終的に再発でなく継続的に結果を抑圧する MRD が残っています。したがって、MRD 細胞の撲滅は、耐久性や治療の応答を達成するために必要です。慢性骨髄性白血病は、精密医学の概念は、発癌、合理的なターゲット向けの治療、病気の進行と薬剤耐性のメカニズムを定義するための貴重なパラダイムします。しかし、今日でも、がん細胞における TKI が誘導する細胞死のメカニズムは十分に理解されていない、またなぜ MRD 細胞 (白血病幹細胞 [LSCs] で構成) がず4,6に本質的に耐性。変異キナーゼ腫瘍を「癌遺伝子依存性」の現象がこによって目標とされた遺伝子急性阻害が大規模なアポトーシス応答またはセルに静穏化につながる発癌ショックを引き起こす TKI 効果に関与しているにもかかわらず、コンテキスト依存的6,7,8,9。ただし、遺伝子依存性のメカニズムの基盤が欠けています。最近の研究は、成長因子シグナリング遺伝子依存性の放棄し、その結果 TKI 療法10、11,12に対する耐性を付与に関与しています。したがって、遺伝子依存性のメカニズムに洞察力を得るためには、BCR ABL1 中毒と C-fos と Dusp1 がの重要なメディエーターであることを明らかにした (成長因子と成長)、nonaddicted の細胞からの全ゲノム発現プロファイリングを行った癌遺伝子中毒13。C-fos と Dusp1 の遺伝子の欠失は合成 BCR ABL1 表現する致命的な細胞、実験に使ったマウス白血病を開発しなかった。また、小分子阻害剤による C-fos と DUSP1 の阻害は、マウスにおける BCR 誘起 ABL1 CML を硬化させます。結果は、その下位レベルより高いレベルの治療13への抵抗を引き起こす間薬剤感受性を協議する C-fos と Dusp1 の発現が癌細胞でアポトーシスしきい値を定義を示します。
運転がん遺伝子依存性遺伝子を識別するためにいくつかの全ゲノム発現マウスと慢性骨髄性白血病患者由来細胞 (K562) の両方を使用して成長因子といって (イマチニブ) 存在下で実験を行った。CD34 から取得した慢性骨髄性白血病患者のデータ セットと並行してこれらのデータを分析した+造血幹細胞イマチニブ治療前後。この分析は、3 つの遺伝子を明らかにした (転写因子 [C-fos]、二重特定性のホスファターゼ 1 [Dusp1] と RNA 結合タンパク質 [Zfp36])、TKI 耐性細胞における一般的。薬剤耐性のこれらの遺伝子の意義を検証するには、ステップバイ ステップの in vitroとin vivoの解析を行った。これらの遺伝子の表現のレベルは、リアルタイム qPCR (RT qPCR) と薬剤耐性細胞のウェスタンブロッティングによって確認されました。さらに、cDNA 発現と Dusp1、C-fos の shRNA ヘアピンによるノックダウンと Zfp36 高架 C-fos と Dusp1 式が TKI 耐性を授けるに必要かつ充分なことを明らかにしました。したがって、のみ C-fos と Dusp1 マウス モデルを用いた生体内での検証を行った。C-fos と Dusp1 の遺伝学的検証、我々 ROSACreERT 誘導性 C-fosフロリダ州/フロリダマウス (条件付きノックアウト)14を作成し、Dusp1-/- (まっすぐノックアウト)15 ROSACreERT2 Fosフロリダ州/フロリダ州をようにそれらを交差させたDusp1-/-ダブル トランスジェニック マウス。C キット+ – 骨髄由来細胞 (Fos からフロリダ州/フロリダ・ Dusp1-/--、および Fosフロリダ州/フロリダ州Dusp1-/-) でコロニー形成単位 (CFU) 試金およびの in vitro解析あった BCR ABL1 を表現します。vivo白血病開発で単独で、または一緒に C-fos と Dusp1 の要件をテストするための致死的に放射線照射したマウスの骨髄移植によって。同様に、DFC (difluorinated クルクミン)16 C-fos と BCI によって Dusp1 の化学阻害 (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17テストされた in vitro および in vivo BCR ABL1-表現、骨を使用して野生型 (WT) マウス骨髄由来の c キット+細胞。白血病幹細胞における C-fos と Dusp1 の要件を確認するには、我々 は、BCR ABL1 は特異的にその幹細胞ドキシサイクリン (テト転写活性化表現するマウスの幹細胞白血病 (SCL) 遺伝子 3′ エンハンサーの下で慢性骨髄性白血病モデルマウスを利用しました。規制)18,19。骨髄林–を用いて生体内での移植試験でこれらのマウスから細胞の Sca+c キット+ (LSK)。さらに、我々 phopsho p38 レベルと Dusp1 と C-fos 阻害の薬物ダイナミック バイオ マーカーとして il-6 の発現がそれぞれ開設、生体内で。最後に、人間の関連性、患者由来の CD34 の研究を拡張する+細胞 (マウスから c キット+細胞に相当) が長期的に受ける体外培養開始細胞アッセイ (LTCIC) との生体内でヒト化マウスモデル慢性骨髄性白血病の20,21。免疫不全マウスは CML CD34 陽性細胞、続いて薬物治療と白血病細胞生存率の解析で移植されました。
このプロジェクトで異なる前臨床モデルを使用してターゲット識別と遺伝的・化学的ツールを使用して検証のためのメソッドを開発します。これらのメソッドは、他の治療開発のための化学療法の開発のターゲットを検証に正常に適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
癌細胞の一括、TKI 治療に対しては腫瘍がはまっているチロシン キナーゼ腫瘍信号の封鎖によって媒介されます。しかし、比較的少しは MRD に貢献する癌細胞の少数が遺伝子依存性と治療4をエスケープする方法について知られています。最近の研究では、ことは白血病や固形臓器腫瘍の薬剤耐性を仲介する成長因子シグナリングを明らかにしました。様々 な分子メカニズム?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は BaF3 WEHI 細胞を提供するため g. q. デイリーに感謝して、MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP の t. Reya を構築します。著者は、CML 爆発危機から患者のサンプルを提供するため m. キャロルに感謝しています。本研究は、NCI (1RO1CA155091)、白血病研究財団と V 財団、NHLBI (R21HL114074-01) から修士に補助金によって支えられました。
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
Referências
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- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
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