Synthese en karakterisering van placenta Chondroitin sulfaat een (plCSA) - Targeting lipide - polymeer nanodeeltjes
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de synthese van placenta chondroitin sulfaat A bindend peptide (plCSA-BP)-geconjugeerd lipide-polymeer nanodeeltjes via -voor-stapmodus ultrasoonapparaat en bioconjugate technieken. Deze deeltjes een roman hulpmiddel vormen voor de gerichte levering van therapeutics aan de meeste menselijke tumoren en placenta trophoblasts voor de behandeling van kanker en placenta aandoeningen.
Abstract
Een effectieve kanker therapeutische methode vermindert en elimineert tumoren met minimale systemische toxiciteit. Actief targeting nanodeeltjes bieden een veelbelovende aanpak van kankertherapie. De glycosaminoglycaan placenta chondroitin sulfaat een (plCSA) wordt uitgedrukt op een breed scala van kankercellen en placenta trophoblasts en malaria eiwit die var2csa specifiek aan plCSA binden kan. Een gerapporteerde placenta chondroitin sulfaat A bindend peptide (plCSA-BP), afgeleid van malaria eiwit VAR2CSA, kan ook specifiek binden aan plCSA op kankercellen en placenta trophoblasts. Vandaar, kon plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes worden gebruikt als een instrument voor gerichte drug levering aan menselijke kankers en placenta trophoblasts. In dit protocol beschrijven we een methode voor het synthetiseren van lipide-polymer plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes geladen met Doxorubicine (plCSA-DNPs); de methode bestaat uit een enkele ultrasoonapparaat stap en bioconjugate technieken. Bovendien worden de verschillende methoden voor het karakteriseren van plCSA-DNPs, met inbegrip van de bepaling van de fysisch-chemische eigenschappen en cellulaire opname door cellen van de placenta choriocarcinoma (JEG3), beschreven.
Introduction
Een effectieve kanker therapeutische methode vermindert en elimineert tumoren met minimale systemische toxiciteit. Vandaar, selectieve tumor richten is de sleutel tot het verkennen van de succesvolle therapeutische methoden. Nanodeeltjes bieden een veelbelovende mogelijkheid voor kankertherapie en moleculaire samenstellingen met verschillende functionele groepen zal verbeteren van de drug werkzaamheid en bijbehorende bijwerkingen1,2te verminderen. Bovendien, nanoparticle systemen voornamelijk gebruik maken van passieve en actieve targeting te bereiken doel tumoren3.
Passieve targeting exploiteert de aangeboren kenmerken van nanodeeltjes en verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effecten te bereiken van tumorcellen. Kationogene liposomen zijn met succes gebruikt om het leveren van diverse geneesmiddelen aan tumoren in klinische toepassingen4,5,6. Ondanks de mogelijke effectieve kanker therapeutische werking, een lage drug-concentratie in de regio van de tumor en een onvermogen om te onderscheiden van tumorcellen van normale weefsels zijn twee belangrijke beperkingen van passief-targeting nanodeeltjes7.
Actieve gerichte strategieën te profiteren van antigeen-antilichaam, ligand-receptor en andere moleculaire erkenning interacties te leveren specifiek drugs aan tumoren8. De glycosaminoglycaan placenta chondroitin sulfaat een (plCSA) wordt over het algemeen uitgedrukt op de meeste kankercellen en placenta trophoblasts. Bovendien, de malaria proteïne VAR2CSA kunt specifiek binden aan de plCSA9,10. VAR2CSA kan dus een hulpmiddel voor het targeten van menselijke kankercellen. Wanneer VAR2CSA is geconjugeerd met nanodeeltjes, kan de full-length proteïne echter de penetratie van nanodeeltjes in tumorcellen beperken. Onlangs ontdekte we een plCSA bindend peptide (plCSA-BP), afgeleid van de malaria proteïne VAR2CSA. plCSA-BP-geconjugeerde lipide-polymeer nanodeeltjes snel gebonden aan de cellen van de choriocarcinoma en beduidend verhoogd Doxorubicine (DOX) antikanker activiteit in vivo11; deze deeltjes ook specifiek gebonden aan placenta trophoblasts en zou kunnen dienen als een instrument voor de beoogde levering van drugs aan de placenta12.
Lipide-polymeer nanodeeltjes bestaat uit een lipide enkelgelaagde shell en een hydrofoob polymeer kern en vertegenwoordigen een nieuwe drager voor drug delivery. Deze nanodeeltjes combineren de voordelen van liposomen en polymere nanocarriers, zoals controleerbare nanoparticle grootte, hoge biocompatibiliteit, aanhoudende drug release, hoge drug laden efficiëntie (LE) en uitstekende stabiliteit13. In dit werk gebruikten we een-voor-stapmodus ultrasoonapparaat methode voor het synthetiseren van lipide-polymeer nanodeeltjes. Deze methode is snel, gemakkelijk en geschikt voor schaalvergroting en is wijd verbeid gebruikt ter voorbereiding van lipide-polymeer nanodeeltjes van onze groep11,14 e.a.15,16,17,18 .
1-ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) is een populaire carbodiimide gebruikt als een agent crosslinking voor biomoleculen met amines en carboxylates19conjugating. Naast EDC is N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) het meest voorkomende vervoeging reagens in oppervlakte- en nanoparticle vervoeging reacties20,21. NHS kan verminderen van het aantal reacties van de kant en verbeteren van de stabiliteit en rendement van ester tussenproducten22,23.
Hier beschrijven we een protocol voor het synthetiseren van lipide-polymer plCSA-gerichte nanodeeltjes. Ten eerste wordt de-voor-stapmodus ultrasoonapparaat synthese van DOX-geladen lipide-polymeer nanodeeltjes (DNPs) beschreven. Vervolgens wordt een EDC/NHS bioconjugate techniek voor het genereren van lipide-polymer plCSA-BP-geconjugeerde nanodeeltjes ingevoerd. Deze bioconjugate-techniek kan ook worden gebruikt om conjugaat van andere antistoffen en peptiden aan nanodeeltjes. Ten slotte, beschrijven we de fysisch-chemische eigenschappen en in vitro assay gebruikt voor het karakteriseren van de plCSA-gerichte lipide-polymeer nanodeeltjes. Wij zijn van mening dat deze plCSA-gerichte lipide-polymeer nanodeeltjes een doeltreffend systeem voor de beoogde levering van drugs naar de meeste menselijke kankers en de gerichte levering van lading aan de placenta te behandelen aandoeningen placenta kunnen vormen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een efficiënte en reproduceerbare methode voor de synthese van plCSA-BP-geconjugeerde lipide-polymeer nanodeeltjes. De methode-voor-stapmodus ultrasoonapparaat te bereiden lipide-polymeer nanodeeltjes is snelle, reproduceerbare en verschilt van de typische nanoprecipitation methoden waarbij Verwarming, vortexing of verdamping. Vandaar, de ontwikkelde methode vermindert het installatieprogramma de synthese-tijd. Bovendien, is de EDC/NHS-bioconjugate gebruikt in dit protocol een algemeen gebruikte en ge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale sleutel-onderzoek en ontwikkeling programma van China (2016YFC1000402), de nationale stichting van de natuurwetenschappen (81571445 en 81771617) en de Natural Science Foundation van Guangdong provincie (2016A030313178) op X.F. en de Shenzhen Basic onderzoeksfonds (JCYJ20170413165233512) naar X.F.
Materials
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
Referências
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid–polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -. M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Pesquisa do Câncer. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Bioquímica. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
