סינתזה ואפיון של היפרדות כונדרויטין גופרתי (plCSA) - מיקוד השומנים - חלקיקי הפולימר
Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לסינתזה של היפרדות כונדרויטין סולפט א איגוד פפטיד (plCSA-BP)-מצומדת השומנים-פולימר חלקיקים באמצעות צעד אחר צעד sonication bioconjugate וטכניקות. חלקיקים אלה מהווים כלי הרומן למסירה יישוב של הרפוי גידולים האנושי ביותר, היפרדות trophoblasts לטיפול סרטן והפרעות היפרדות.
Abstract
שיטה טיפולית יעילה לסרטן מפחית ומסלקת גידולים עם רעילות מינימלית מערכתית. חלקיקים באופן פעיל מיקוד מציעים גישה מבטיחה לטיפול בסרטן. גליקוזאמינוגליקן היפרדות כונדרויטין סולפט (plCSA) מתבטאת במגוון רחב של תאים סרטניים trophoblasts היפרדות, ואת מלריה חלבון ש-var2csa ניתן לאגד במיוחד plCSA. פפטיד מחייב דווח על היפרדות כונדרויטין סולפט A (plCSA-BP), נגזר מלריה חלבון VAR2CSA, באפשרותך לאגוד גם באופן ספציפי כדי plCSA על התאים הסרטניים, היפרדות trophoblasts. לפיכך, plCSA-BP-מצומדת חלקיקים יכול לשמש ככלי למשלוח שיגור תרופות סרטן אנושיים, היפרדות trophoblasts. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לסנתז plCSA-BP-מצומדת השומנים-פולימר חלקיקים טעונים עם דוקסורוביצין (plCSA-DNPs); השיטה מורכבת צעד בודד sonication וטכניקות bioconjugate. בנוסף, מספר שיטות אפיון plCSA-DNPs, כולל החלטה physicochemical תכונותיהם ואת ספיגת התאית על ידי תאים choriocarcinoma היפרדות (JEG3), מתוארים.
Introduction
שיטה טיפולית יעילה לסרטן מפחית ומסלקת גידולים עם רעילות מינימלית מערכתית. ומכאן, גידול סלקטיבי המיקוד הוא המפתח לחקור שיטות טיפוליות מוצלחות. חלקיקים מציעים הזדמנות מבטיחה לטיפול בסרטן, הרכבות מולקולרית עם קבוצות פונקציונליות שונות לשפר את יעילות התרופה ולצמצם את תופעות לוואי המשויך1,2. יתר על כן, ננו-חלקיק מערכות לנצל בעיקר פסיביים ואקטיביים מיקוד כדי להגיע למטרה גידולים3.
פילוח פסיבי מנצלת את מאפייני מולדת של חלקיקים, חדירות משופרת ואפקטים השמירה (EPR) כדי להגיע תאים סרטניים. ליפוזומים cationic שימשו בהצלחה להעביר תרופות נגד סרטן שונים גידולים יישומים קליניים-4,–5,–6. למרות ההשפעה הפוטנציאלי טיפולית יעילה לסרטן, ריכוז נמוך סמים באזור הגידול ואת חוסר היכולת להבחין בין תאים סרטניים מרקמות נורמלי הן שתי מגבלות הגדולות של חלקיקים פסיבית פילוח7.
אסטרטגיות מיקוד פעיל את היתרון של אנטיגן-נוגדן, קולטן ליגנד אחרים ואינטראקציות הכרה מולקולרית במיוחד לספק סמים גידולים8. גליקוזאמינוגליקן היפרדות כונדרויטין סולפט (plCSA), מתבטאת בהרחבה על רוב התאים הסרטניים, היפרדות trophoblasts. יתר על כן, החלבון מלריה VAR2CSA יכול במיוחד לאגד9,plCSA10. לפיכך, VAR2CSA יכול להיות כלי מיקוד תאים סרטניים אנושיים. עם זאת, כאשר VAR2CSA היא מצומדת כדי חלקיקים, החלבון באורך מלא עלולה להגביל את חדירת חלקיקים לתוך תאים סרטניים. לאחרונה גילינו פפטיד איגוד plCSA (plCSA-BP), נגזר החלבון מלריה VAR2CSA. plCSA-BP-מצומדת השומנים-פולימר חלקיקים במהירות בונדד choriocarcinoma תאים, דוקסורוביצין ולעלייה משמעותית (DOX) פעילות נגד סרטן ויוו11; חלקיקים אלה גם באופן ספציפי בונדד כדי היפרדות trophoblasts, יכול לשמש כלי למסירה יישוב של סמים כדי שליה12.
השומנים-פולימר חלקיקים מורכבים של פגז טפט השומנים, גרעין הידרופובי פולימריים ולייצג נשא חדש עבור משלוח סמים. חלקיקים אלה לשלב את היתרונות של ליפוזומים, nanocarriers פולימריים, כגון גודל nanoparticle לשליטה, הביו גבוהה, שחרור התרופה מתמשכת, סמים גבוהה הטעינה יעילות (LE) יציבות מעולה13. בעבודה זו, השתמשנו בשיטה צעד אחר צעד sonication לסנתז השומנים-פולימר חלקיקים. שיטה זו מהירה, נוח ומתאים הסולם, כבר בשימוש נרחב כדי להכין השומנים-פולימר חלקיקים שלנו11,קבוצה14 ואחרים15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide הידרוכלוריד (EDC) הוא carbodiimide הפופולרי משמש כסוכן crosslinking conjugating מולקולות המכילות אמינים, carboxylates19. בנוסף EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) היא הכימית ההטיה הנפוצה ביותר השטח, ננו-חלקיק ההטיה תגובות20,21. NHS באפשרותך להפחית את מספר ריאקציות צדדיות ולשפר את היציבות ואת התשואה של אסתר intermediates22,23.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור סינתזה השומנים-פולימר, ממוקדות plCSA חלקיקים. ראשית, מתואר הסינתזה sonication צעד אחר צעד של חלקיקים טעונים DOX שומנים בדם-פולימר (DNPs). לאחר מכן, הוא הציג טכניקה bioconjugate EDC/NHS ליצירת חלקיקים plCSA-BP-מצומדת השומנים-פולימר. טכניקה זו bioconjugate יכול לשמש גם כדי נזווג נוגדנים אחרים, פפטידים כדי חלקיקים. לבסוף, אנו מתארים וזמינותו המאפיינים ואת במבחנה physicochemical המשמש לאפיון חלקיקים, ממוקדות plCSA השומנים-פולימר. אנו מאמינים כי חלקיקים אלה השומנים-פולימר, ממוקדות plCSA עשויה להוות מערכת יעילה עבור המשלוח יישוב של תרופות סרטן אנושיים ביותר ואת משלוח יישוב דים לטיפול בהפרעות היפרדות השליה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה לשחזור ויעיל עבור סינתזה plCSA-BP-מצומדת השומנים-פולימר חלקיקים. בשיטת צעד אחר צעד sonication להכין את השומנים-פולימר חלקיקים הוא מהיר, הדירים שונה בשיטות nanoprecipitation טיפוסי כולל חימום, vortexing או אידוי. לפיכך, השיטה שפותחה מפחית באופן משמעותי את הזמן סינתזה. בנוסף, bioconjugate EDC/NHS בשי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המחקר מפתח הלאומי, תוכנית פיתוח של סין (2016YFC1000402), הקרן מדעי הטבע הלאומית (81571445 ו- 81771617), את מדעי הטבע קרן של בפרובינצית גואנג-דונג (2016A030313178) כדי X.f. ב, קרן מחקר בסיסי שנג’ן (JCYJ20170413165233512) כדי x.f. ב
Materials
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
Referências
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid–polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -. M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Pesquisa do Câncer. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Bioquímica. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
