Síntesis y caracterización de placenta condroitina sulfato (plCSA) - Targeting lípido - nanopartículas de polímero
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la síntesis del péptido de Unión placentaria condroitin sulfato A (plCSA-BP)-conjugados polímero lipídico nanopartículas via solo paso sonicación y bioconjugate técnicas. Estas partículas constituyen una novedosa herramienta para la entrega específica de la terapéutica para tumores más humanos y trofoblastos placentarios para tratar cánceres y trastornos placentarios.
Abstract
Un método terapéutico eficaz cáncer reduce y elimina tumores con mínima toxicidad sistémica. Nanopartículas activamente dirigida a ofrecen un enfoque prometedor para la terapia del cáncer. El sulfato de condroitina placentaria glycosaminoglycan (plCSA) se expresa en una amplia gama de las células cancerosas y trofoblastos placentarios y palúdica proteína que var2csa puede atar específicamente a plCSA. Un péptido de Unión placentaria divulgado el sulfato de condroitina A (plCSA-BP), derivado de proteína de la malaria VAR2CSA, puede enlazar también específicamente plCSA en las células cancerosas y trofoblastos placentarios. Por lo tanto, las nanopartículas conjugadas de BP plCSA podrían utilizarse como una herramienta para el suministro de medicamentos dirigidos a los cánceres humanos y trofoblastos placentarios. En este protocolo, se describe un método para sintetizar lípidos-polímero conjugado de BP plCSA nanopartículas cargadas con doxorrubicina (plCSA-DNPs); el método consiste en una técnica de sonicación solo paso y bioconjugate. Además, se describen varios métodos para la caracterización de plCSA-DNPs, incluyendo la determinación de sus propiedades fisicoquímicas y la absorción celular de las células de coriocarcinoma placentario (JEG3).
Introduction
Un método terapéutico eficaz cáncer reduce y elimina tumores con mínima toxicidad sistémica. Por lo tanto, selectiva tumor targeting es la clave para explorar métodos terapéuticos exitosos. Nanopartículas ofrecen una oportunidad prometedora para tratamiento del cáncer, y conjuntos moleculares con diferentes grupos funcionales serán mejorar la eficacia de los medicamentos y reducir los efectos secundarios asociados1,2. Por otra parte, nanopartículas sistemas utilizan principalmente pasiva y activa dirigida a para alcanzar el objetivo tumores3.
Orientación pasivo explota las características innatas de nanopartículas y permeabilidad mejorada y los efectos de la retención (EPR) para llegar a las células del tumor. Liposomas catiónicos se han utilizado con éxito para entregar varios medicamentos anticancerosos a tumores en aplicaciones clínicas4,5,6. A pesar del potencial efecto terapéutico de cáncer eficaz, una concentración baja de drogas en la región del tumor y una incapacidad para distinguir las células tumorales de los tejidos normales son dos limitaciones importantes de nanopartículas dirigidas a pasivo7.
Activadas estrategias dirigida a toman ventaja de antígeno-anticuerpo, ligando-receptor y otras interacciones de reconocimiento molecular específicamente entregar drogas a tumores8. El sulfato de condroitina placentaria glycosaminoglycan (plCSA) se expresa ampliamente en la mayoría de las células cancerosas y trofoblastos placentarios. Por otra parte, la proteína de la malaria VAR2CSA puede atar específicamente a plCSA9,10. Por lo tanto, VAR2CSA puede ser una herramienta para apuntar las células de cáncer humano. Sin embargo, cuando VAR2CSA es conjugados a nanopartículas, la proteína de larga duración puede limitar la penetración de nanopartículas en las células del tumor. Recientemente, descubrió un péptido de Unión plCSA (plCSA-BP), derivado de la proteína de la malaria VAR2CSA. nanopartículas de polímero lipídico plCSA BP conjugado enlazado rápidamente a células de coriocarcinoma y aumentó significativamente la doxorrubicina (DOX) actividad anticancerosa en vivo11; Estas partículas también específicamente adheridos a trofoblastos placentarios y podrían servir como una herramienta para la entrega específica de drogas a la placenta12.
Nanopartículas de polímeros lípidos consisten en una cáscara de monocapa de lípidos y un núcleo polímero hidrofóbico y representan un portador nuevo de la entrega de la droga. Estas nanopartículas combinan las ventajas de liposomas y nanocarriers poliméricos, tales como tamaño de nanopartícula controlable, alta biocompatibilidad, liberación sostenida del fármaco, eficacia de drogas alta carga (LE) y excelente estabilidad13. En este trabajo, utilizamos un método de sonicación solo paso para sintetizar nanopartículas de polímero lipídico. Este método es rápido, conveniente y adecuado para escala-para arriba y ha sido ampliamente utilizado para la preparación de nanopartículas de polímero lipídico por nuestro grupo11,14 y otros15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) clorhidrato de carbodiimida (EDC) es una carbodiimida popular utilizada como agente de reticulación para conjugar la biomoléculas que contiene aminas y carboxylates19. Además de EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) es el reactivo verbal más común en la superficie y nanopartículas Conjugación reacciones20,21. NHS puede reducir el número de reacciones secundarias y mejorar la estabilidad y rendimiento de éster intermediarios22,23.
Aquí, describimos un protocolo para la síntesis de nanopartículas de polímero lipídico plCSA dirigidos. En primer lugar, se describe la síntesis de sonicación solo paso de nanopartículas de polímero de lípidos cargados de DOX (DNPs). Luego, se introduce una técnica de bioconjugate EDC/NHS para la generación de nanopartículas de polímero lipídico plCSA-BP-conjugados. Esta técnica de bioconjugate puede utilizarse también para conjugar otros anticuerpos y péptidos a nanopartículas. Finalmente, describimos el análisis de propiedades y en vitro fisicoquímico utilizado para caracterizar las nanopartículas de polímeros de lípidos plCSA dirigidos. Creemos que estas nanopartículas de polímero lipídico plCSA dirigida podrían constituir un sistema eficaz para la entrega específica de fármacos para cánceres más humanos y la entrega específica de cargas a la placenta para tratar los trastornos placentarios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona un método eficiente y reproducible para la síntesis de nanopartículas de polímero lipídico plCSA-BP-conjugados. El método de sonicación solo paso para la preparación de nanopartículas de polímero lipídico es rápido, reproducible y diferente del típico nanoprecipitation métodos que implican calentamiento, Vortex o evaporación. Por lo tanto, el método desarrollado reduce significativamente el tiempo de síntesis. Además, la EDC/NHS bioconjugate utilizado en este protocolo es una …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la nacional clave de investigación y programa de desarrollo de China (2016YFC1000402), la Fundación Nacional de Ciencias naturales (81571445 y 81771617) y la Fundación Ciencias naturales de la provincia de Guangdong (2016A030313178) a X.F. y el fondo de investigación básica de Shenzhen (JCYJ20170413165233512) a X.F.
Materials
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
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