Синтез и характеристика плаценты хондроитин сульфат (plCSA) - ориентация липидов - полимер наночастиц
Summary
Здесь мы представляем собой протокол для синтеза плацентарной хондроитин сульфат A привязки пептида (plCSA-BP)-конъюгированных липидов полимер наночастиц через единый этапа sonication и биоконъюгатов методов. Эти частицы являются роман инструмент для доставки целевых терапевтических средств большинство человеческих опухолей и плацентарной трофобласты для лечения рака и плацентарной расстройств.
Abstract
Лечебный метод эффективного рака уменьшает и устраняет опухоли с минимальными системной токсичности. Активно таргетинга наночастиц предлагают перспективный подход к терапии рака. Глюкозаминогликан плацентарной хондроитин сульфат (plCSA) выражается на широкий спектр раковых клеток и плаценты трофобласты и малярийные белка, который VAR2CSA конкретно можно привязать к plCSA. Также специально сообщил плацентарной хондроитин сульфат A привязки пептида (plCSA-BP), производные от малярии белка VAR2CSA, можно привязать к plCSA на раковые клетки и плацентарной трофобласты. Таким образом plCSA ВР конъюгированных наночастиц могут использоваться как инструмент для доставки целевых наркотиков человека раковые заболевания и плацентарной трофобласты. В этом протоколе мы описываем метод синтеза наночастиц plCSA BP-конъюгированных липидов полимер, загружен с доксорубицином (plCSA-DNPs); Этот метод состоит из одного sonication шаг и биоконъюгатов методов. Кроме того несколько методов для квалификации plCSA-DNPs, включая определение их физико-химических свойств и клеточного поглощения клетками плаценты хориокарцинома (JEG3), описаны.
Introduction
Лечебный метод эффективного рака уменьшает и устраняет опухоли с минимальными системной токсичности. Следовательно ориентация избирательного опухоли является ключом к изучению успешных терапевтические методы. Наночастицы предлагает многообещающие возможности для лечения рака, и повысит эффективность препарата и снизить связанные побочные эффекты1,2молекулярной сборки с различными функциональными группами. Кроме того наночастиц системы главным образом используют, пассивной и активной ориентации для достижения цели опухоли3.
Пассивной ориентации эксплуатирует врожденные характеристики наночастиц и повышение проницаемости и удержания (EPR) эффекты для достижения опухолевых клеток. Катионный липосомы успешно использовался для доставки различные противораковые препараты опухоли в клинических приложений4,5,6. Несмотря на потенциал эффективного рака терапевтический эффект концентрация низкая наркотиков в регионе опухоли и неспособность отличить опухолевых клеток от нормальных тканей являются два основных ограничения ориентации пассивного наночастиц7.
Активной ориентации стратегий воспользоваться антиген антитела, лиганд рецептор и другие взаимодействия молекулярного распознавания специально доставить опухоли8препаратов. Глюкозаминогликан плацентарной хондроитин сульфат (plCSA) широко выражается на большинство раковых клеток и плаценты трофобласты. Кроме того малярийные белка VAR2CSA можно конкретно связать plCSA9,10. Таким образом VAR2CSA может быть инструментом для ориентации человеческих раковых клеток. Однако когда VAR2CSA конъюгированных с наночастицами, полнометражные белка может ограничить проникновение наночастиц в опухолевые клетки. Недавно мы обнаружили plCSA пептид привязки (plCSA-BP), производные от малярии белка VAR2CSA. plCSA ВР конъюгированных липидов полимер наночастиц быстро тычковой хориокарцинома клетки и значительно увеличили доксорубицин (DOX) противоопухолевую активность в vivo11; Эти частицы также конкретно связан с плацентарной трофобласты и может служить инструментом для целенаправленной доставки препаратов плаценты12.
Липидов полимер наночастицы состоят из липидной оболочки монослоя и гидрофобных полимерных ядро и представляют новый носитель для доставки лекарств. Эти наночастицы сочетают в себе преимущества липосомы и полимерных nanocarriers, таких как размер управляемой наночастиц, высокой биосовместимостью, устойчивый наркотиков релиз, эффективность загрузки высокий препарата (LE) и отличную стабильность13. В этой работе мы использовали sonication одношаговый метод для синтеза липидов полимер наночастиц. Этот метод быстро, удобно и подходит для масштабирования и широко использовался подготовить липидов полимер наночастиц нашей группы11,14 и другие15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Карбодиимиды гидрохлорид (EDC) является популярным Карбодиимиды, используется в качестве агента сшивки для спрягать биомолекул, содержащие амины и карбоксилатов19. В дополнение к EDC N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) является наиболее распространенным спряжение реагента в поверхность и наночастиц спряжение реакции20,21. NHS может уменьшить количество побочных реакций и укреплению стабильности и доходности эфира промежуточные22,23.
Здесь мы описываем протокол для синтеза наночастиц plCSA ориентированные липидов полимер. Во-первых описан пошагово sonication синтеза наночастиц DOX-загружен липидов полимера (DNPs). Затем вводится методом биоконъюгатов EDC/NHS для генерации plCSA BP-конъюгированных липидов полимер наночастиц. Эта техника биоконъюгатов может также использоваться для конъюгата других антител и пептиды наночастиц. Наконец мы описываем физико-химических свойств и в пробирке assay, используемые для характеристики plCSA ориентированные липидов полимер наночастиц. Мы считаем, что эти наночастицы целевых plCSA липидов полимер может стать эффективной системы для целенаправленной доставки лекарств для большинства человеческих раков и целенаправленной доставки полезной нагрузки плаценты для лечения плацентарной расстройств.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол обеспечивает эффективное и воспроизводимый метод синтеза наночастиц plCSA BP-конъюгированных липидов полимер. Метод single-step sonication подготовить липидов полимер наночастиц быстро, воспроизводимые и отличается от типичных nanoprecipitation методов, которые включают Отопление, vortexing ил?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана субсидии от национального исследования ключ и Программа развития Китая (2016YFC1000402), Национальный фонд естественных наук (81571445 и 81771617) и Фонд провинции Гуандун естественных наук (2016A030313178) для X.F. и Шэньчжэнь Basic исследовательский фонд (JCYJ20170413165233512) X.F.
Materials
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
Referências
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid–polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -. M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Pesquisa do Câncer. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Bioquímica. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
