Sintesi e caratterizzazione di placenta condroitina solfato un (plCSA) - Targeting del lipido - nanoparticelle polimeriche
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la sintesi del peptide di associazione placentare condroitina solfato A (plCSA-BP)-coniugato del lipido-polimero nanoparticelle via passo singolo sonicazione e bioconjugate tecniche. Queste particelle costituiscono un nuovo strumento per la somministrazione mirata di terapeutica di tumori più umani e trofoblasto placentare per trattare tumori e disturbi placentare.
Abstract
Un metodo terapeutico del cancro efficace riduce ed Elimina i tumori con minima tossicità sistemica. Le nanoparticelle attivamente targeting offrono un approccio promettente per la terapia del cancro. Il solfato della condroitina placentare glycosaminoglycan un (plCSA) è espresso su una vasta gamma di cellule tumorali e trofoblasto placentare e malarica proteine che var2csa in particolare può essere associato a plCSA. Un peptide di associazione segnalata placentare condroitina solfato A (plCSA-BP), derivato dalla proteina malarica VAR2CSA, specificamente anche possibile associare a plCSA sulle cellule tumorali e trofoblasto placentare. Quindi, plCSA-BP-coniugato nanoparticelle potrebbero essere usate come uno strumento per somministrazione di farmaci mirati a cancri umani e trofoblasto placentare. In questo protocollo, descriviamo un metodo per sintetizzare nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero caricate con doxorubicina (plCSA-DNPs); il metodo consiste in un singolo sonicazione passo e bioconjugate tecniche. Inoltre, sono descritti diversi metodi per la caratterizzazione plCSA-DNPs, compresa la determinazione di loro proprietà fisico-chimiche e l’assorbimento cellulare di cellule placentari coriocarcinoma (JEG3).
Introduction
Un metodo terapeutico del cancro efficace riduce ed Elimina i tumori con minima tossicità sistemica. Quindi, targeting tumorale selettiva è la chiave per esplorare metodi di successo terapeutici. Le nanoparticelle offrono un’opportunità promettente per la terapia del cancro, e molecolare assembly con diversi gruppi funzionali saranno che permettono di migliorare l’efficacia dei farmaci e ridurre gli effetti collaterali associati1,2. Inoltre, i sistemi di nanoparticella utilizzano principalmente attivi e passivi di targeting per raggiungere target tumori3.
Passivo di targeting sfrutta le caratteristiche innate di nanoparticelle e permeabilità migliorata ed effetti di ritenzione (EPR) per raggiungere le cellule del tumore. Liposomi cationici sono stati utilizzati con successo per fornire varie droghe anticancro a tumori in applicazioni cliniche4,5,6. Nonostante il potenziale effetto terapeutico del cancro efficace, una concentrazione di farmaco basso nella regione del tumore e un’incapacità di distinguere le cellule del tumore dai tessuti normali sono due principali limitazioni del passivo-targeting nanoparticelle7.
Strategie di targeting attive approfitta di antigene-anticorpo, ligando-recettore e altre interazioni di riconoscimento molecolare per consegnare i farmaci specificamente a tumori8. Il solfato della condroitina placentare glycosaminoglycan un (plCSA) è largamente espresso sulla maggior parte delle cellule tumorali e trofoblasto placentare. Inoltre, la proteina malarica VAR2CSA specificamente possibile associare a plCSA9,10. Quindi, VAR2CSA può essere uno strumento per il targeting di cellule tumorali umane. Tuttavia, quando VAR2CSA è coniugato a nanoparticelle, la proteina full-length può limitare la penetrazione di nanoparticelle nelle cellule del tumore. Recentemente, abbiamo scoperto un peptide di associazione plCSA (plCSA-BP), derivato dalla proteina malarica VAR2CSA. plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero nanoparticelle rapidamente legato ad coriocarcinoma cellule e significativamente aumentato doxorubicina (DOX) attività antitumorale in vivo11; Queste particelle anche specificamente legato al trofoblasto placentare e potrebbero servire come strumento per la somministrazione mirata di farmaci per la placenta12.
Le nanoparticelle lipidiche-polimero sono costituiti da un guscio di monostrato lipidico e un nucleo idrofobo polimerico e rappresentano un nuovo vettore per la consegna della droga. Queste nanoparticelle combinano i vantaggi dei liposomi e polimerici nanovettori, quali dimensioni delle nanoparticelle controllabile, elevata biocompatibilità, rilascio prolungato di farmaci, efficienza di carico alta droga (LE) e un’eccellente stabilità13. In questo lavoro, abbiamo usato un metodo a passo singolo sonicazione per sintetizzare nanoparticelle lipidiche-polimero. Questo metodo è veloce, comodo e adatto per scale-up ed è stato ampiamente utilizzato per preparare nanoparticelle lipidiche-polimero dal nostro gruppo11,14 e gli altri15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide cloridrato (EDC) è un popolare carbodiimide usato come un agente di reticolazione per biomolecole contenenti ammine e carbossilati19di coniugazione. Oltre a EDC, N-Idrossisulfosuccinimide (NHS) è il più comune reagente di coniugazione in superficie e nanoparticelle coniugazione reazioni20,21. NHS può ridurre il numero di reazioni secondarie e migliorare la stabilità e rendimento di estere intermedi22,23.
Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero. In primo luogo, la sintesi di passo singolo sonicazione delle nanoparticelle di DOX-caricati del lipido-polimero (DNPs) è descritto. Quindi, una tecnica di bioconjugate EDC/NHS per la generazione di nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero è stato introdotto. Questa tecnica di bioconjugate è utilizzabile anche per coniugare altri anticorpi e peptidi alle nanoparticelle. Infine, descriviamo l’analisi fisico-chimica di proprietà e in vitro utilizzato per caratterizzare le nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero. Crediamo che queste nanoparticelle di targeting per plCSA del lipido-polimero potrebbero costituire un sistema efficace per la somministrazione mirata di farmaci per tumori più umani e la somministrazione mirata di payload di placenta per trattare i disordini placentari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo efficace e riproducibile per la sintesi di nanoparticelle plCSA-BP-coniugato del lipido-polimero. Il metodo di passo singolo sonicazione per preparare nanoparticelle lipidiche-polimero è veloce, riproducibile e diverso dai metodi di nanoprecipitazione tipici che coinvolgono riscaldamento, Vortex o evaporazione. Quindi, il metodo sviluppato riduce significativamente il tempo di sintesi. Inoltre, l’EDC/NHS bioconjugate utilizzato in questo protocollo è una tecnica comunemente usata e …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da nazionali chiave della ricerca e sviluppo programma della Cina (2016YFC1000402), la Fondazione nazionale di scienze naturali (81571445 e 81771617) e la Fondazione con scienze naturali della provincia di Guangdong (2016A030313178) per Il fondo di ricerca di Shenzhen Basic (JCYJ20170413165233512) a X.F. e X.F.
Materials
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
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