Summary
Protokollen beskrevet her gør det muligt for forskere at specifikt ændre adenovirus capsids på udvalgte steder ved simple kemi. Afskærmet adenovirus vektorer partikler og tilpassede gen overførsel vektorer kan genereres, og vektor værtssammenspil kan studeres.
Abstract
Adenovirus vektorerne er potent værktøj til genetiske vaccination og oncolytic virotherapy. Men de er udsat for flere uønskede vektor-værtssammenspil, især efter i vivo levering. Det er en enighed om, at de begrænsninger af uønskede vektor-værtssammenspil kan kun overvindes, hvis definerede ændringer af vektor overflade er udført. Disse ændringer omfatter afskærmning af partikler fra uønskede vekselvirkninger og målretning af indførelsen af nye ligander. Målet med protokollen præsenteres her er at give læseren til at generere afskærmet og, hvis det ønskes, tilpassede menneskelige adenovirus gen overførsel vektorer eller oncolytic virus. Protokollen vil sætte forskerne ændre overfladen af adenovirus vektor capsids af specifikke kemiske fastgørelse af syntetiske polymerer, kulhydrater, lipider, eller andre biologiske eller kemiske fraspaltning. Det beskriver den banebrydende teknologi af kombineret genetiske og kemiske kapsid ændringer, som har vist sig at lette forståelsen og overvindelse af hindringer for i vivo levering af adenovirus vektorer. En detaljeret og kommenteret beskrivelse af de afgørende skridt for at udføre specifikke kemiske reaktioner med biologisk aktive virus eller virus-afledte vektorer er fastsat. Den teknologi, der er beskrevet i protokollen er baseret på genetisk indførelsen af (naturligvis fraværende) cystein restkoncentrationer i opløsningsmiddel-eksponerede sløjfer af adenovirus-afledte vektorer. Disse cystein restkoncentrationer giver en bestemt kemisk reaktivitet, der kan, efter produktionen af vektorer til høj titers, udnyttes til meget konkrete og effektive kovalente kemiske kobling af molekyler fra et bredt udvalg af stof klasser at vektoren partikler. Vigtigere, kan denne protokol let tilpasses til at udføre en bred vifte af forskellige (ikke-thiol-baserede) kemiske modifikationer af adenovirus vektor capsids. Endelig er det sandsynligt at ikke-kappebærende virus-baseret gen overførsel vektorer end adenovirus kan ændres fra grundlaget for denne protokol.
Introduction
Adenovirus (Ad), medlemmer af familien Adenoviridae, er ikke-kappebærende DNA virus hvilke mere end 70 typer har hidtil været identificeret (http://hadvwg.gmu.edu). Afhængig af hemaglutination egenskaber, genom struktur og sekventering resultater, kan 70 annoncetyper opdeles i syv arter (menneskelige adenovirus A til G)1,2. Den menneskelige Ad genom er 38 kb i størrelse og indkapslet af en ikosaedriske nucleocapsid3. På grund af deres overflod, er kapsid proteiner hexon, penton base og fiber alle benævnt store kapsid proteiner. Den største og mest rigelige kapsid proteiner hexon udgør 20 kapsid facetter, hver bestående af 12 hexon homotrimers4,5. Penton, placeret på hver ikosaedriske kant (toppunkt), består af pentamers af en penton base og repræsenterer base for vertex spike, som er bygget af glykosyleret fiber trimere5,6. Den oprindelige annonce celleindtastning er dybest set består af to hovedtrin. Først, fiber knop binder sig til den primære receptor. I annoncetyper fra arter A, C, E og F er dette coxsackie og adenovirus receptoren (bil). Denne interaktion bringer virion i geografisk nærhed af cellens overflade, dermed at lette samspillet mellem cellulære integriner og M.H.T.-motiv i penton base og derfor overtalelse cellulære svar. For det andet ændringer i cytoskeleton fører til internalisering af virion og transport til endosome7. Efter delvis adskillelse i endosome, virion frigives til cytoplasma und i sidste ende rejser til kernen til replikering.
Mens annonce kan leveres lokalt (fx., for genetiske vaccination), systemisk levering gennem blodbanen som krævet for Kræftpsykologisk-virotherapy står over for flere barrierer. Samtidig cirkulerer i blodbanen, støder injiceres virioner forsvarssystem i værtens immunsystem, fører til hurtig neutralisering af de virus-baseret vektorer og rendering annonce-baseret vektorer ekstremt ineffektive i systemisk applikationer. Desuden, den naturlige hepatotropism annonce forstyrrer systemisk levering og skal løses til at omdirigere annonce til sin nye target-cellerne.
Genom-kodet naturlige IgM antistoffer af den medfødte immunsystem hurtigt genkende og binde hyppigt gentagne strukturer på overfladen af virion8,9. Disse immunkomplekser derefter aktivere den klassiske og ikke-klassisk veje af komplementsystemet, fører til hurtig komplement-medieret neutralisering af en stor del af virioner8. En anden vej, resulterer i større fjernelse af annonce virioner er medieret af makrofager10 og forbundet med akut toksisk og hæmodynamiske bivirkninger11,12. For Ad navnlig Kupffer celler i leveren binder til og phagocytically tage op Ad virioner via specifikke skyllevæske receptorer, således at fjerne dem fra blod13,14,15 . Specifikke skyllevæske receptorer er også blevet identificeret på leveren sinusformet endotelceller (LSE celler)16, og LSE celler også synes at bidrage til vektor eliminering17, men til hvilket omfang stadig behov for afklaring. Desuden, nogle annoncetyper og deres afledte vektorer er effektivt afsondret af menneskelige erytrocytter18 som de binder via bil eller supplere receptor CR119. Bemærk, dette kompleksdannere mekanisme kan studeres i mus modelsystem som i modsætning til menneskelige erytrocytter, mus erytrocytter udtryk ikke bil.
Specifikke anti-annonce antistoffer genereret af adaptive immunsystem efter udsættelse for annonce enten på grund af tidligere infektioner med annonce eller efter den første levering i systemisk programmer hæve en yderligere hindring for effektiv brug af Ad vektorer, og de bør omgås i effektiv systemisk levering.
Endelig, den stærke hepatotropism af nogle annoncetyper (herunder Ad5) alvorligt hindrer anvendelsen af annonce i systemisk terapi. Denne tropisme, hvilket resulterer i hepatocyt transduktion skyldes Ad virion høj affinitet til blod koagulationsfaktor X (FX), medieret af samspillet mellem FX med Ad hexon protein20,21,22. FX broer virion til heparin sulfat glycans (HSPGs) på overfladen af hepatocytter20,23,24,25. En afgørende faktor for denne interaktion synes at være det specifikke omfang af N - og O-sulfation af HSPGs i leverceller24, som er forskellig fra HSPGs på andre celletyper. Ud over denne FX-medieret vej tyder nylige undersøgelser på yderligere veje endnu ikke identificeret dette resultat i annonce transduktion af hepatocytter26,27,28.
For nylig, det har vist sig at FX ikke er kun involveret i hepatocyt transduktion af annonce, men også ved at binde sig, virion skjolde virus partikel mod neutralisering af komplement systemet26. Reduktion af hepatocyt transduktion ved at forhindre FX bindende, derfor ville skabe den uønskede bivirkning af stigende Ad neutralisering via det medfødte immunforsvar.
Et dybtgående kendskab til det komplekse samspil mellem vektorer og værtsorganismer er derfor nødvendigt at udvikle mere effektive vektorer for systemisk applikationer, at omgå hindringer pålagt af den værtsorganisme.
En strategi, der oprindeligt er brugt til terapeutiske proteiner er blevet tilpasset for annonce vektorer til i det mindste delvist løse de ovenfor beskrevne barrierer. Antigenicity og immunogenicitet af terapeutiske protein forbindelser kan reduceres ved at koble til polyethylenglycol (PEG)29,30. Derfor, den kovalente kobling af polymerer såsom PIND eller poly [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid] (pHPMA) til kapsid overflade skjolde vektoren fra uønskede vektor-værtssammenspil. Almindeligt, polymer kobling mål ε-amine grupper fra lysin side rester, der er tilfældigt fordelt på kapsid overflade. Vektor partikler i løsning er, på grund af hydrofile karakteren af de vedlagte polymerer, omgivet af en stabil vand shell, der reducerer risikoen for immun celle anerkendelse eller Enzymatisk nedbrydning. Derudover var pegyleret Ad vektorer vist at unddrage sig neutralisering af anti-hexon antistoffer i in vitro og i pre immuniserede mus i vivo31. I modsætning til genetiske kapsid ændringer, er kemiske kobling af polymerer udført efter produktion og rensning, tillader ikke blot brugen af konventionelle producent celler og produktion af høj titer vektor bestande, men også for samtidige ændring af tusindvis af aminosyrer på kapsid overflade. Dog opstår Amin-instrueret afskærmning tilfældigt i hele hele kapsid overflade, hvilket resulterer i høj heterogeneities og ikke giver mulighed for ændring af specifikke capsomers. Desuden, de store polymer fraspaltning kræves for gavnlige virkninger forringe virus bioactivity32.
At overvinde disse begrænsninger, Kreppel mfl. 33 indført en genetiskmodificeredeorganismer-kemisk begreb for vektor re- og de-målretning. Cysteines indført genetisk virus kapsid på opløsningsmiddel-udsatte positioner som fiber HI-loop33, protein IX34og hexon35,36. Selv om ikke naturligt forekommende, cystein-bærende Ad vektorer kan fremstilles på høj titers i normal producent celler. Vigtigere, indsættelse af cysteines i visse capsomers og i forskellige positioner inden for en enkelt capsomer giver mulighed for meget specifikke ændringer af thiol gruppe-reaktiv fraspaltning. Denne genetiskmodificeredeorganismer-kemiske tilgang har vist sig at overvinde mange forhindringer i annonce vektor design. Kombinationen af amin-baseret PEGylation til detargeting og thiol-baserede kobling af transferrin fiber knappen HI-loop er blevet bevist med held retarget modificeret Ad vektorer til bil-mangelfuld celler33. Da hexon er involveret i de mest uønskede vekselvirkninger (neutraliserende antistoffer, blod koagulationsfaktor FX), blev thiol-baserede ændring strategier også anvendt til hexon. Kobling lille PIND fraspaltning til HVR5 af hexon forhindret Ad vektor partikler til at transduce SKOV-3 celler i overværelse af FX, store PLØK fraspaltning steg hepatocyt transduktion14,35. Annonce vektor partikler bærer mutationer i fiber knop hæmme bil bindende og HVR7 hæmmende binding af FX (og forsynet med indsat cysteines i HVR1 for stilling-specifik PEGylation) var vist at unddrage sig antistof - og komplement-medieret neutralisering, samt skyllevæske receptor-medieret optagelse uden tab af smitteevne. Interessant nok, trods manglende naturlige FX skjoldet forbedret PEGylation igen transduktion af hepatocytter som en funktion af PIND størrelse36. Dog var det vist at kovalente afskærmning har en indvirkning på intracellulære menneskehandel processer. Prill mfl. sammenlignet med uoprettelige versus bioresponsive skjolde baseret på pHPMA og viste, at hverken tilstanden af afskærmning eller co-polymer afgift haft indvirkning på celleindtastning men påvirkede partikel handel til kernen. Ansætte en bioresponsive skjold med positivt ladede pHPMA Co polymere tilladt for partikel handel til kernen, opretholde de høje transduktion effektivitetsgevinster af annonce vektorer i in vitro og i vivo37.
I Resumé viser disse data, at selv under den antagelse, at alle vektor-værtssammenspil var kendt og anset, overdreven kapsid overflade ændringer er nødvendige for at overvinde de forhindringer, der er forbundet med systemisk vektor levering.
Her giver vi en protokol for at udføre lokationsspecifikke kemiske modifikationer af adenovirus vektor capsids for afskærmning og/eller retargeting adenovirus vektor partikler og adenovirus-baserede oncolytic virus. Begrebet denne teknologi er skitseret i figur 1. Det giver mulighed for afskærmning af visse kapsid regioner fra uønskede vekselvirkninger af kovalent fastgørelse af syntetiske polymerer. Samtidig giver det også et middel til at knytte ligander og kombinere afskærmning og målretning. Ved hjælp af simple kemi bliver eksperimentatorer kovalent redigere adenovirus vektor overflade med en bred vifte af molekyler herunder peptider/proteiner, kulhydrater, lipider og andre små molekyler. Derudover giver protokollen et generelt koncept for den kemiske modifikation af biologisk aktive virus-afledte vektorer under vedligeholdelse af deres biologiske integritet og aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: I følgende en protokol for genetiskmodificeredeorganismer-kemiske PEGylation af en annonce vektor er beskrevet for detaljer. Hvis du vil aktivere specifikke kobling af PIND gruppe, en Ad5 vektor var på forhånd genetisk modificeret ved at indføre en cystein restkoncentrationer i hexon protein på hypervariable loop 5, som beskrevet i en tidligere publikation36, og et maleimide-aktiveret PIND sammensatte bruges som kobling sammensat.
1. forberedelse af buffere til vektor rensning af CsCL trin forløb
- Forbered 400 mL af Adenovirus buffer (Ad-buffer) ved at tilføje 50 mM HEPES (4.76 g/400 mL) og 150 mM NaCl (3.504 g/400 mL) til dobbeltdestilleret vand (ddH2O). 350 mL af denne buffer er nødvendig for at forberede de følgende tre Ad-buffer varianter.
- Variant A: justere 150 mL af annonce-buffer til pH 7,6 med NaOH.
- Variant B: Tilføj en slutkoncentration på 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.143 g] til 50 mL og justere det til pH 7,2 med HCl.
- Variant C: tilføje en endelig koncentration på 0,5 mM TCEP (0,022 g) til 150 mL og justere det til pH 7,2 med HCl.
- Forberede buffere i ddH2O og kemikalier af analysekvalitet. Bruge 100 mL hver variant A og variant C for at forberede CsCl-buffere (Se trin 1,2 og 1,3; 50 mL af hver) nødvendige for CsCl trin gradienter (Se trin 3.2.6. og 3.2.18).
- Forberede CsCl trin gradient buffer (ρCsCl = 1.41 g/cm3) i Ad-buffer
Bemærk: Denne buffer vil være behov for to forskellige variationer:- Veje to delprøver af præcis 27.42 g af CsCl i 50 mL rør.
- ΡCsCl = 1,41/TCEP buffer: løse CsCl i 40 mL variant C af annonce-buffer.
- ΡCsCl = 1.41 buffer: løse CsCl i 40 mL variant A Ad-buffer.
- Kontroller, og om nødvendigt indstilles pH med HCl. Fyld op til præcis 50 mL med den tilsvarende annonce-buffer variant. For at opnå de bedste resultater, adskillelse, er den nøjagtige CsCl og pH-værdi afgørende.
- Kontrollere tæthed (CsCl indhold) af vejer 1 mL (1.41 g) af hver gradient buffer.
- Forberede CsCl trin gradient buffer (ρCsCl = 1,27 g/cm3) i Ad-buffer
Bemærk: Denne buffer er nødvendig i to forskellige varianter:- Veje to delprøver af præcis 18.46 g CsCl i 50 mL rør.
- ΡCsCl = 1,27/TCEP buffer: løse CsCl i 40 mL variant C af annonce-buffer.
- ΡCsCl = 1,27 buffer: løse CsCl i 40 mL variant A Ad-buffer.
- Kontroller, og Juster om nødvendigt pH med HCl. Endelig, fylde op til præcis 50 mL med den tilsvarende annonce-buffer variant. For at opnå de bedste resultater, adskillelse, er den nøjagtige CsCl og pH-værdi afgørende.
- Kontrollere tæthed (CsCl indhold) af vejer 1 mL (1,27 g) af hver gradient buffer.
- Sterilisere alle buffere (Ad-buffere og CsCl trin gradient buffere) ved filtrering (med porestørrelse 0,45 µm mesh) i sterile flasker.
- Efter sterilisation, for at forhindre oxidation af TCEP, mætte og overlay buffere indeholdende TCEP med argon ved sparging buffere med argon gas for omkring 30 s. Vær omhyggelig med at kun bruge sterilt udstyr (fx., sterile afpipetteres tips) ved anvendelsen af argon gas og brug flasker store nok til at tillade argon spæk.
Bemærk: Alle stødpuder bør være forberedt friske og beskyttet mod lys og kan opbevares ved 4 ° C for flere dage (især de CsCl trin gradient buffere, der bør kun opbevares i et par dage).
2. kobling fraspaltning: Opbevaring og tilberedning
Bemærk: Moeities anvendes for kobling til cysteines skal bære thiol-reaktive grupper. Maleimide-aktiveret forbindelser vil danne stabile thioether obligationer med genetisk indførte cysteines. Alternativt, ortho-pyridyldisulfide (OPSS)-aktiverede forbindelser kan bruges, som udgør bioresponsive disulfidbroer mellem vektor partikler og kobling gruppe. Frysetørret malPEG-750 samt de fleste andre kobling reagenser er følsomme over for hydrolyse og bør opbevares tørt i form af frysetørret pulver ved-80 ° C.
- For at forhindre ophobning af kondenserende vand ved optøning af hætteglassene, gemme hætteglassene i større rør (fx., 50 mL rør) fyldt med en pude af silica gel perler. Opbevar disse rør i en passende større beholder også fyldt med en silicagel perle pude.
- Inden tæt lukning hver tube og container, udveksle luft med argon gas. Dette kan opnås ved at placere den åbne rør og beholdere i en ekssikkator, efterfulgt af fjernelse og udskiftning af luften med argon gas. Da argon gas er tungere end luft, rør og beholdere er fyldt med argon gas og kan nu placeres ind i hinanden, med hver låget tæt lukket.
- Store containere ved-80 ° C.
- Når optøning, skal du placere containere på silica perler i en ekssikkator og langsomt varme dem op til stuetemperatur, så åbnes beholderen.
- Når du udfører en kobling reaktion, frisk løse mængden af kobling substrat behov i den passende opløsningsmiddel. Passe på ikke for at tilføje mere end 10% af kobling løsning til den endelige kobling reaktion, især hvis DMF eller DMSO anvendes som opløsningsmiddel for kobling substrat.
3. forstærkning, rensning og kemisk ændring af annonce vektorer:
- Forstærkning af annonce vektorer
Bemærk: Følgende trin skal udføres ved hjælp af en sikkerhed fryser efter lokale biologiske sikkerhedsregler.- Transfect en replikering mangelfuld ∆E1 Ad vektor indeholdende en (eller flere) genetisk indførte cystein restkoncentrationer i HEK 293 celler som beskrevet af Kratzer og Kreppel38.
- Ifølge protokollen38, forstærke vektoren af sekventielle reinfections op til en sidste forberedende infektion i 15-20 store (15 cm) celle kultur plader (ca. 1-2 x 107 celler/plade).
Bemærk: Optimalt, den sidste reinfektion bør blive timet således at celler Vis fuld cytopatisk effekt (CPE) om morgenen af rensning og modifikation ydeevne (Se figur 2). - Efter trinnet endelige forstærkning kan celler genopslemmes i Ad buffer + 10 mM TCEP (variant B) fryses ved-80 ° C; Men, for optimal udbytte af vektor partikler anbefales en umiddelbar opfølgning af celle lysis og vektor rensning og modifikation.
- Rensning og kemisk ændring af annonce vektorer
Bemærk: Rensning af vektorer er udført efter adenovirus rensning protokol beskrevet i38men ikke oxiderende betingelser. Celle høst og lysis samt vektor rensning og kemiske modifikation kan udføres inden for én dag. Høst og lyse inficerede celler efter protokol tidligere beskrevet38.- Indsamle celler ved skrabning pladerne og overføre supernatanten til 200-500 mL centrifugering rør.
- Spin den celle løsning i 10 min på 400 x g.
- Resuspenderes celle i 4 mL af annonce-buffer + 10 mM TCEP (pH 7,2) (variant B) og overførsel til en steril 50 mL tube. Hvis celle afkast er lavt eller kun en svag CPE blev induceret, resuspend det i 2 mL.
- Redde vektoren af 3 cyklusser af nedfrysning (i flydende kvælstof) og optøning (i et 37 ° C vandbad).
- Spin i 10 min på 5.000 x g ved 4 ° C.
- Mens centrifugering, forberede to lig CsCl trin forløb:
- Først som den nederste fase, tilsættes 3 mL 1.41 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffer + 0,5 mM TCEP (pH 7,2, variant C) i ultracentrifuge rør. Markere niveauet for den nederste fase på røret inden du lægger den øverste fase.
- Forsigtigt stak den øverste fase 5 ml af 1,27 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffer + 0,5 mM TCEP (pH 7,2, variant C) meget langsomt når der afpipetteres 5 mL volumen langs væggene i røret på den nederste fase.
Bemærk: Siden under kobling en høj koncentration af TCEP kunne reagere med maleimide rester af malPEG-750 og føre til reduceret kobling effektivitet, rensning af CsCl trin gradient skal udføres allerede under en reduceret TCEP koncentration.
- Indlæse supernatanten på CsCl gradient [enten lige så opdele supernatanten på begge forløb eller, ved en lav vektor udbytte (se ovenfor), indlæse supernatanten kun én kolonne], og fylder begge forløb lige til toppen med annonce buffer + 10 mM TCEP (pH 7 .2, variant B).
- Justere vægten af de modsatte rør til en 0,0 g vægtforskel.
- Ultracentrifuge i 2 timer ved 176.000 x g ved 4 ° C.
- Fix ultracentrifugering rør til et stativ, forlader området omkring den nederste fase niveau mark tilgængelig med en klemme. Placere svanehals lampe over røret. Omkring mark, på grænsen mellem de øvre og nedre faser, bør et særskilt band (vektor virioner) være synlige (figur 3A-3 C).
- Indsamle vektorerne ved punktering røret med en nål og håbefulde vektor band i en sprøjte. Overføre indsamlede vektor virioner til en 15 mL tube.
Bemærk: Svagere bands over Ad vektor band indeholder ufuldstændige vektor partikler og bør undgås for aspiration. Celle debris og grønt fluorescerende proteiner (EGFP) af EGFP-udtrykker annonce-vektorer vil samle sig i den øverste del af ultracentrifuge tube (Se figur 3A og 3B). Dette og de følgende trin op til kobling (trin 3.2.16) skal udføres hurtigt, som vektorerne er nu fornuftigt at disulfid limning på grund af den lave TCEP koncentration. - For at beregne mængden af kobling substrat behov for effektive komplet binding af substrat for alle cystein rester i vektor forberedelse, måle OD260:
- Ifølge protokollen beskrevet af Kratzer og Kreppel38, vortex en blanding af 10 µL af de indsamlede vektor virioner, 89 µL af annonce buffer og 1 µL af 10% SDS. Som en tom sonde, vortex 99 µL af annonce-buffer og 1 µL af 10% SDS.
- Ruger både ved 56 ° C i 10 min til at denaturere virioner.
- Bestemme OD260.
- Beregne fysiske vektor titer pr. µL ved hjælp af følgende ligning: OD260 x faktor af fortynding x empirisk bestemt extinction koefficient af annonce (1,1 x 109 vektor partikler = 1 OD260 enhed/µL). Derfor en målte OD260 1,36 af en vektor fortyndet 1:10, ville beregne til: 1.36 x 10 x 1,1 x 109 = ca 1.5 x 1010 vektor partikler/µL.
Bemærk: Denne titer er kun et groft skøn; men det er nøjagtig nok for de støkiometriske beregninger skitseres i det følgende.
- Afhængigt af proteinet ændret ved indførelsen af en cystein, bestemme mængden af kobling substrat (i gram) for en effektiv kobling reaktion, efter følgende generelle ligning: Virus titer x volumen x antallet af cysteines x overskud af gruppe x Molekylær vægt af gruppe / 6,022 x 1023 = gram kobling substrat.
Bemærk: I denne ligning: 1) virus titer er titer/µL, bestemmes af OD260 som beskrevet ovenfor, 2) volumen konti for volumen i µL af magerens vektor, der anvendes i kobling reaktion, 3) antallet af cysteines er antallet af proteiner, som cystein rester blev indført pr. vektor partikel, 4) overskud af gruppe er faktoren af gruppe overskydende nødvendige for en effektiv kobling reaktion (50 x), og 5) molekylvægt af gruppe skal indføres som Da (ikke kDa). - Frisk løse mængden af sammensatte (eller realistisk beløb) i den passende opløsningsmiddel.
Bemærk: Som mængden af kobling substrat behov er lav og vanskeligt at afveje men dyrt, vejer den minimale mængde af sammensatte muligt og opløse den i en passende koncentration for ansøgning til kobling reaktion. - Vektor opløsning overføres til en passende størrelse rør (f.eks. 2 mL tube) og tilføje det beregnede beløb for koblingen sammensatte stamopløsning til vektor.
- Bland forsigtigt løsningen af overhead rotation i 1 time ved stuetemperatur.
- Fylde vektor løsningen 6 mL samlede volumen med Ad-buffer (pH 7,6, variant A).
Bemærk: Dette trin skal udføres, før løsningen anvendes til trin forløb for at sikre, at vektor-løsning, der stadig indeholder CsCl fra den første trin gradient, har en densitet under 1,27 g/mL. - I en anden CsCl banding trin, rense vektoren fra ureageret kobling gruppe:
- Forbered to lig CsCl trin forløb ved at udføre følgende trin for hver: 1) lavere fase: 3 mL af 1.41 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffer (pH 7,6, variant A), 2) markere niveau lavere fase på røret inden du ilægger øvre, og 3) øverste fase : 5 mL af 1,27 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffer (pH 7,6, variant A).
Bemærk: Efter kobling har fundet sted, buffere uden TCEP anvendes, som ingen gratis thiol grupper bør nu være til stede på vektor capsids. - Indlæse supernatanten på CsCl gradient og fylde begge forløb lige til toppen med Ad-buffer (pH 7,6, variant A).
- Justere vægten af de modsatte rør til en 0,0 g vægtforskel.
- Forbered to lig CsCl trin forløb ved at udføre følgende trin for hver: 1) lavere fase: 3 mL af 1.41 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffer (pH 7,6, variant A), 2) markere niveau lavere fase på røret inden du ilægger øvre, og 3) øverste fase : 5 mL af 1,27 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffer (pH 7,6, variant A).
- Ultracentrifuge i 2 timer ved 176.000 x g ved 4 ° C.
- Kort før udløbet af ultracentrifugering reagensglasset en PD-10 kolonne 5 gange med 5 mL af annonce-buffer (pH 7,6, variant A).
- Som gjort i trin 3.2.10, lave ultracentrifugering tube valgbarhed forlader området omkring den nederste fase niveau mark tilgængelige. Placere svanehals lampe over røret. Igen, omkring grænsen mellem de øvre og nedre faser, et særskilt band (vektor virioner) bør være synlige (figur 3 c).
- Indsamle vektorerne ved punktering røret med en nål og håbefulde vektor band i en sprøjte, og overføre vektoren til en 15 mL tube. Sørge for at indsamle virioner af begge gradient rør sammen som et 2,5 mL volumen eller mindre. Hvis en mindre volumen er indsamlet, udfylde for at få et 2,5 mL volumen med annonce buffer (variant A).
- Indlæse 2,5 mL den afbalancerede PD-kolonne. Kassér gennemstrømnings.
- Tilføj 3 mL Ad buffer (variant A) over på kolonnen og indsamle den gennemstrømning (der indeholder renset vektor virioner).
- Tilføje glycerol (333 µL) for at opnå en endelig koncentration på 10% og opdele i passende delprøver (f.eks. 400 µL hver), og omfatter en alikvot af 20 µL titer bestemmelse af OD260 måling.
- Butik vektor løsning ved-80 ° C.
- Bestemme titer af vektor ved at måle OD260 20 µL vektor løsning, 79 µL af annonce-buffer (variant A) og 1 µL af 10% SDS som beskrevet i trin 3.2.12. Som en tom, bruge 79 µL af annonce-buffer (variant A), 10 µL af 10% glycerol og 1 µL af 10% SDS.
- Beregne vektor titer som: OD260 x faktor af fortynding x 1,1 x 109 vektor partikler/µL.
Som tilberedes på skridt 3.2.27, beregne: OD260 x 5 x 1,1 x 109 vektor partikler/µL
4. bekræftelse af kobling af SDS-PAGE:
Bemærk: Hvis forbindelser med tilstrækkelig høj Molekylær vægt anvendes for kobling til annonce virioner, kobling kan verificeres ved polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). Vellykket kobling bør derefter resultere i en forskydning af protein bandet svarer til den ændrede Ad virion protein, sammenlignet med protein i den umodificerede Ad virion (Se figur 4).
- Ifølge den beregnede titer af vektor (trin 3.2.28), separat 1-2 x 1010 vektor partikler af SDS-PAGE (8%).
- Udvikle gel af sølv-farvning af gel39 hen til opdager selv svage protein bands:
- Forberede buffere sølv farvning (de beløb, der er nødvendige for 100 mL buffer er angivet i parentes):
- Forberede buffer 1 ved at blande 38 mL af Hedeselskabet2O, 50% MeOH (50 mL af 100 MeOH), 12% AcOH (12 mL 100% AcOH), og 0.0185% HCHO (50 µL af 37% HCHO).
- Forbered buffer 2 ved at tilføje 50% EtOH (50 mL 100% EtOH) til 50 mL af Hedeselskabet2O.
- Forbered buffer 3 ved at tilføje 0.127 g/L Na2S2O3 (12.744 mg) til 100 mL af Hedeselskabet2O.
- Forbered buffer 4 ved at tilføje 2 g/L AgNO3 (0,2 g) og 0.0185% HCHO (50 µL af 37% HCHO) til 100 mL af Hedeselskabet2O.
- Forbered buffer 5 ved at tilføje 60 g/L Na2CO3 (6 g), 0.0185% HCHO (50 µL af 37% HCHO), og 2,5 mg/L Na2S2O3 (0.256 mg) til Hedeselskabet2O at opnå en endelige rumfang på 100 mL.
- Forberede buffer 6 ved at blande 38 mL af Hedeselskabet2O, 50% MeOH (50 mL 100% MeOH), og 12% AcOH (12 mL 100% AcOH).
- Forberede buffer 7 ved at blande 60 mL af Hedeselskabet2O, 30% MeOH (30 mL 100% MeOH), og 10% glycerin (10 mL af 100% glycerin).
- Forberede buffer 8 ved at blande 10% glycerin (10 mL af 100% glycerin) med 90 mL af Hedeselskabet2O.
- Forberede buffere sølv farvning (de beløb, der er nødvendige for 100 mL buffer er angivet i parentes):
- Udførelse af sølv farvning
- Fix gelen i buffer 1 i 30 min.
- Vaske gel i buffer 2 for 15 min.
- Forbehandle gel i buffer 3 i 1 minut.
- Vaske gel 3 gange i ddH2O for 20 s.
- Imprægnere gel i buffer 4 til 20 min.
- Vask gelen 2 gange i ddH2O for 20 s.
- Udvikle gel i buffer 5 indtil bands er synlige (10 s til 10 min).
- Vask gelen 2 gange i ddH2O i 2 min.
- Stoppe udviklingen i buffer 6 i 5 min.
- Bevare gel i buffer 7 til 20 min.
- Opbevar gelen i buffer 8.
Bemærk: Kobling effektivitet kan bestemmes ved densitometric kvantificering af de modificerede og umodificeret bands af den målrettede capsomere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser eksempler på for cytopatisk effekt (CPE) på 293 (HEK 293) celler, der angiver vellykket vektor produktion. Celler skal vise morfologi (figur 2 c) 40-48 timer efter podning med virus vektor. Det rigtige tidspunkt for høst er afgørende for ikke at miste viruspartikler af celle lysis og forhindrer oxidation af genetisk indførte thiol grupper. Hvis vektor partikler frigives til mellemlang af celle lysis, de genetisk indførte dithioler vil næsten øjeblikkeligt blive oxideret, og det vil blive vanskeligt at rense og kemisk ændre dem.
Figur 3 viser eksemplarisk CsCl bands. Formålet med diskontinuert CsCl banding før kemisk ændring er at fjerne cellular vragdele fra viruspartikler. Ændringen, selv kan derefter finde sted i CsCl. Den anden banding efter kemiske modifikation tjener til at fjerne et overskud af (ureageret) kobling gruppe. Bemærk, en vellykket ændring af virus kan ikke ses i farveforløbet og kræver yderligere Molekylær analyse, ideelt ved SDS-PAGE.
Figur 4 viser typiske eksempler på vellykket kapsid ændringer. De fleste fraspaltning koblet til specifikke capsomeres vil ændre respektive capsomeres i SDS-PAGE kører adfærd. Ved direkte sammenligning med en umodificeret kontrol, succes af kobling kan kontrolleres, og densitometric analyse kan hjælpe med at bestemme samlede kobling effektivitet (procent af flyttet og unshifted bands for den modificerede capsomere).
Figur 1: kombineret genetiske og kemiske kapsid ændringer af adenovirus vektor capsids aktiverer kovalente udlæg i afskærmning polymerer og målretning ligander. Cystein rester er genetisk indført på udvalgte, opløsningsmiddel-eksponerede kapsid sløjfer af adenovirus vektor capsids at udstyre vektor partikler med nye kemisk reaktivitet. Vektorer kan være fremstillet ved hjælp af konventionelle producent celler og protokoller. Efter produktion, er genetisk indførte cystein rester specifikt og kovalent modificeret med thiol-reaktiv kobling fraspaltning (ligander, afskærmning polymerer, kulhydrater, små molekyler, fluorescerende farvestoffer, osv.). For kobling, kan maleimide-aktiveret forbindelser, (der udgør stabile thioether obligationer med vektor partikel overflade) eller pyridyldisulfide derivater (der udgør bioresponsive disulfidbroer) være ansat. Efter kobling, er vektorerne renset af diskontinuert CsCl banding for at fjerne ureageret overskydende kobling fraspaltning. PIND, polyethylenglycol (afskærmning polymer); Larsen, ligander (afledt fra en bred vifte af stof klasser); -SH, thiol funktionalitet af genetisk indførte cystein rester. Brug af denne teknologi, et defineret antal molekyler kan være kovalent koblet til vektor capsids, og et præcist udvalg af webstedet kobling er muligt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: cytopatisk effekt under vektor produktionen. Konventionelle producent celler (her, 293-HEK celler) kan bruges til produktion af de genetisk modificerede vektorer før kemiske modifikation. Udseendet af CPE angiver det bedste tidspunkt at høste cellerne. (A) celler to timer efter infektion, b celler 24 timer efter infektion, og (C) celler 40 timer efter infektion før høst. Skalere barer = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksemplarisk resultater af CsCl gradienter. CsCl forløb før (A, B) og efter (C) kemiske modifikation. (A) en adenovirus vektor er stribede ved diskontinuerlige CsCl tæthed gradient centrifugering. Den øverste fase vises grønne siden vektor vist bærer en hCMV-promotor-drevet udtryk kassette til EGFP. Vektor virion er stribede som en enkelt, hvid bandet i den nederste tredjedel af røret. De to mindre bands (ovenfor) stammer fra ufuldstændige partikler, som ikke bør indsamles. (B) en cystein-bærende EGFP-udtrykker Ad vektor før kemiske modifikation. (C) den samme vektor efter ændring. Bandet i den nederste tredjedel af røret bliver indsamlet og renset af en udvanding kolonne. Pen mark i B og C etiketter grænsen mellem de to tætheder og giver mulighed for at identificere placeringen af vektor bandet, der vil blive indsamlet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: SiIver-farvede SDS-PAGE at vurdere kobling effektivitet. MW markør i lane 1. En vektor med cysteines tilføres capsomeres penton base, og hexon blev efterladt uændret (lane 2) eller modificeret med maleimide-aktiveret PIND (polyethylen glycol) med en molekylevægt på 5 kDa (lane 3). Både hexon og penton base udviser et skift i løbet af SDS-PAGE, der angiver vellykket ændring af > 90% af monomerer pr. kapsid. En vektor med cystein rester i hexon var efterladt uændrede (lane 4), ændret med 5 kDa PIND (lane 5) eller 20 kDa PIND (lane 6). Det skal bemærkes, at den større skift i hexon-band er på grund af den højere molekylvægt af de 20 kDa PIND, i forhold til de 5 kDa PIND (lane 5). Gelen viser specificitet og effektiviteten af koblingen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den effektivitet, hvormed de genetisk indførte cysteines kan være kemisk modificeret er typisk 80-99%, og visse variabler påvirker effektiviteten. For det første er det afgørende, at de genetisk indførte cysteines ikke undergår for tidlig oxidation. Samtidig være godt beskyttet i den reducerende miljø af producent celler, er det obligatorisk at give en ikke-oxidative miljø efter at slippe vektor partikler fra producent celler og under kemisk modifikation. Med henblik herpå, reducere reagenser kan bruges i koncentrationer fra 0,1-10 mM, og det er nødvendigt at bruge reducerende reagenser, der ikke indeholder thiol grupper, der ønsker let reagerer med maleimide-aktiveret forbindelser. For det andet, når du bruger maleimide-aktiveret forbindelser, bør pH under kobling reaktion ikke overstige 7,35, siden en pH-værdi på mere end 7,4 kan falde specificiteten af reaktionen. For det tredje, under alle omstændigheder Amin-fri buffere (f.eks. HEPES, PBS) bør anvendes for reaktionen. Af note, kan cystein-bærende vektor partikler renses af dobbelt CsCl banding som beskrevet, og derefter lagret i HEPES/10% glycerol før kemiske modifikation. I dette tilfælde 0,1-1 mM TCEP bør anvendes et reagens for at reducere, eller helst, vektorer bør opbevares i en argon atmosfære. Argon-fyldt plast krukker med låg kan bruges til dette formål. Derudover påvirkes ændring effektivitet af de hydrodynamiske diameter af den sammensatte koblet til capsids og sitet som det er koblet. Mange capsomeres, der kan tjene som mål for den specifikke genetiskmodificeredeorganismer-kemiske modifikation er til stede i kapsid som trimere (fiber, hexon) eller pentamers (penton base). Derfor, afhængigt af placeringen af den genetisk indførte cystein, en gruppe molekyle koblet til en monomer kan sterically hæmme kobling af et andet molekyle til den nærliggende monomer. Dette bør overvejes, når du vælger ideelle steder for genetiskmodificeredeorganismer-kemiske kapsid ændringer.
For at lette fejlfinding, kan et par problemer opstå, når efter protokollen beskrevet. Første, lav vektor udbytter (under 10.000 vektor partikler pr. producent celle) kan skyldes suboptimal infektion af producent celler. 100-300 MOI bør ideelt set anvendes til infektion af producent celler. Bemærk venligst at både for højt og for lavt vektor beløb for inokulat generere suboptimal udbytter. Det er ideelt at passage producenten celler dagen før infektionen. Andet, smeary bands i CsCl forløb kan vises. Den hyppigste årsag til smeary udseende af bands i CsCl-forløb er et pH i CsCl løsninger, thats for sure. Den reducerende reagens TCEP er meget sure, og skal sørges for at justere pH før pålæsning vektor ind på gradueringen, da adenovirus vektorer smuldre let i et surt miljø. Tredje, lav tilkoblingsanordning effektiviseringer (< 80% af kobling) er det hyppigste resultatet af urene vektor præparater og/eller for tidlig oxidation af thiol grupper på vektor overflade. Urenheder kan påvises ved SDS-PAGE og sølv farvning. I tilfælde af at signifikante urenheder opstår, skal vektor produktion genstartes. Derudover kan lav tilkoblingsanordning effektiviseringer være forårsaget af gratis ikke-vektor dithioler i reaktionen. Derfor anbefales det ikke at bruge ß-mercaptoethanol eller dithiothreitol som reducerer reagenser, da begge indeholder gratis thiol grupper. Bemærk, at vælge opløsningsmiddel-tilgængelige websteder at indføre cystein reststoffer, der kan let ændres, bør crystal strukturer anvendes; ellers, at cysteines muligvis ikke have adgang til kobling partner. Tidlig oxidation af dithioler på vektor overflade kan undgås ved den strenge anvendelse af argon og/eller TCEP.
Endelig, forkert støkiometriske beregninger kan også føre til lavt tilkoblingsanordning effektiviseringer. I følgende eksempel er beregnet til at illustrere den generiske formel præsenteret ovenfor og lette de støkiometriske beregninger. I eksemplet med er en cystein indført i hexon capsomere. Titer af vektor partikler efter den første CsCl trin gradient rensning bestemmes som 1.5 x 1010 vektor partikler pr. µL, og koblingen gruppe, malPEG-750 bruges. Hver vektor kapsid indeholder 720 hexon proteiner (240 trimere), så titer af cysteines pr. µL derfor summer til 720 x 1,5 x 1010 = 1,08 x 1013 cysteines/µL. For at ændre 1,5 mL af vektor partikler, 1.62 x 10 i alt skal16 cysteines være reagerede med kobling gruppe. For at opnå effektiv kobling, 50 x kindtand overskud af koblingen sammensatte til summen af cystein restkoncentrationer anbefales: 1,62 x 1016 x 50 = 8.1 x 1017 molekyler af malPEG-750 er nødvendig for at effektivt par til 1.5 x 1016 cysteines af 1,5 mL af vektor løsning renset af den første CsCl trin gradient. MalPEG-750 udstiller en molekylevægt på 750 Da; Derfor vejer 6.022 x 1023 molekyler af malPEG-750 750 g. Derfor, for effektiv kobling af 1.62 x 1016 cystein restkoncentrationer i 1,5 mL af vektor løsning med et 50 x overskud af malPEG-750, 8.1 x 1017 molekyler af malPEG-750 = (750 x 8.1 x 1017) / (6,022 x 1023) = 1 x 10-3 g = 1 mg malPEG-750 er påkrævet.
Metoden præsenteres supplerer og overskrider metoden til vektor PEGylation. Konventionelle, Amin-instrueret vektor PEGylation tillader ikke for lokationsspecifikke fastgørelse af afskærmning eller målretning fraspaltning, genetiskmodificeredeorganismer-kemiske kobling teknologi præsenteres her kan anvendes til netop tillægger adenovirus vektor fraspaltning overflader på definerede positioner og i definerede kopi numre. Det er derfor velegnet til både afskærmning og målretning af adenovirus vektor partikler.
Bemærk, kan denne protokol også bruges til en konventionel Amin-rettet PEGylation Ad vektorer nævnt ovenfor. I så fald kan den reducerende reagens TCEP udelades fra buffere. Støkiometriske beregninger, antallet af tilgængelige amine grupper pr. partikel kan betragtes som 18.000 og typiske kindtand udskejelser af amin-reaktiv kobling fraspaltning er 20-100 fold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
References
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).
- van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
- Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
- Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
- Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
- Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
- Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
- Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
- Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
- Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
- Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
- Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
- Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
- Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
- Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
- Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
- Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
- Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
- Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
- Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
- Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
- Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
- Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
- O'Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
- Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
- Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
- Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).
- Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
- Prill, J. -M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
- Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 377-388 (2017).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).
