Summary
Ce manuscrit décrit la synthèse d’un nanotube de carbone monoparoi (NCM)-conjugué MALAT1 gapmer antisens ADN d’oligonucléotide (SWCNT-anti-MALAT1), qui montre la remise fiable du NCM et le puissant effet thérapeutique de anti-MALAT1 in vitro et in vivo. Méthodes utilisées pour la synthèse, de modification, de conjugaison, et injection de SWCNT-anti-MALAT1 sont décrites.
Abstract
Le nanotube de carbone monoparoi (NCM) est un nouveau type de nanoparticules, qui a été utilisé pour livrer plusieurs sortes de drogues dans les cellules, tels que des protéines, des oligonucléotides et médicaments à petites molécules synthétiques. Le NCM a dimensions personnalisables, une vaste zone superficielle et peut se lier avec souplesse avec des médicaments par le biais de différentes modifications sur sa surface ; par conséquent, c’est un système idéal pour transporter les médicaments dans les cellules. ARN long non codantes (lncRNAs) est un amas d’ARN non codant plu de 200 nt, qui ne peut pas être traduit en protéine, mais joue un rôle important dans les processus biologiques et physiopathologiques. Associées aux métastases pulmonaires adénocarcinome transcription 1 (MALAT1) est une lncRNA hautement conservée. Il a été démontré que des niveaux plus élevés de MALAT1 concernent le mauvais pronostic de divers cancers, notamment le myélome multiple (MM). Nous avons révélé que MALAT1 régule l’ADN réparation et la mort cellulaire en MM ; ainsi, MALAT1 peut être considéré comme une cible thérapeutique pour MM. Cependant, l’efficience de l’oligo antisens pour inhiber/knockdown MALAT1 in vivo est toujours un problème. Dans cette étude, nous modifier le NCM avec PEG-2000 et conjugué un oligo anti-MALAT1 à elle, tester la livraison de ce composé in vitro, injecter par voie intraveineuse dans un modèle de souris MM disséminé et observer une inhibition significative de la progression de MM, ce qui indique cette SWCNT est une navette de livraison idéal pour anti-MALAT1 gapmer ADN.
Introduction
Le NCM est un nanomatériau roman qui peut fournir différents types de médicaments, comme les acides nucléiques, protéines et petites molécules stablement et efficacement avec la tolérabilité idéale et toxicité minimale1 de la vitro et in vivo2. Un SWCNT fonctionnalisé a grande solubilité de biocompatibilité et de l’eau, peut être utilisé comme un service de navette pour les molécules plus petites et peut transporter pour pénétrer la membrane de la cellule3,4,5.
lncRNAs sont un amas d’ARN (> 200 nt) qui sont transcrits à partir du génome à l’ARNm, mais ne peut pas être traduit en protéines. Augmentant la preuve a démontré que les lncRNAs participent à la régulation de l' expression de gène6 et sont impliqués dans l’apparition et la progression de la plupart des types de cancer, y compris MM7,8,9. MALAT1 est une transcription non codante nucléaire enrichi 2 (NEAT2) et un lncRNA hautement conservée10. MALAT1 est initialement reconnu métastatique pulmonaire non à petites cellules (NSCLC) le cancer11, mais a été surexprimé dans nombreuses tumeurs5,12,13; Il est l’un de le lncRNAs plus fortement exprimée et est corrélé à un mauvais pronostic en MM8,14. Le niveau d’expression de MALAT1 est significativement plus élevé chez les cours fatal extramédullaire MM par rapport à ceux diagnostiqués uniquement sous la forme MM15.
Dans une étude précédente, nous avons confirmé qu’anti-MALAT1 oligos conduire fermement pour dommages à l’ADN et l’apoptose dans MM16 en utilisant des oligonucléotides antisens d’ADN gapmer ciblage MALAT1 (anti-MALAT1) dans les cellules MM. L’ADN de gapmer est composé d’ADN antisens et relié par 2'-OMe-ARN, qui pourrait inciter un clivage MALAT1 par la RNase H activité liée une fois17. L’efficacité de livraison in vivo des oligonucléotides antisens limite toujours son utilisation clinique.
Pour tester la livraison effet de SWCNT pour anti-MALAT1 gapmer oligos, l’anti-MALAT1 gapmer ADN est conjugué à la DSPE-PEG2000-amine fonctionnalisés NCM. Le NCM-anti-MALAT1 est ensuite injectée par voie intraveineuse dans un modèle de souris disséminée MM ; On observe une inhibition frappante après quatre traitements.
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Protocol
Toutes les expériences impliquant des animaux ont été pré-approuvé par le Cleveland Clinic IACUC (Comité de l’emploi et animalier institutionnel).
1. synthèse du simple couche fonctionnalisés
- Mélanger 1 mg de simple couche, 5 mg de DSPE-PEG2000-Amine et 5 mL d’eau exempte de nucléase stérilisée dans un flacon en verre de scintillation (20 mL). Secouez bien pour dissoudre tous les réactifs complètement.
- Laisser agir le flacon dans un sonicateur de bain d’eau à un niveau de puissance de 40 W pendant 1 h à température ambiante (RT, 20 min x 3, changez l’eau toutes les 20 min pour éviter les surchauffes). Ensuite, il centrifuger à 24 000 x g pendant 6 h et recueillir le surnageant. Cette solution SWCNT fonctionnelle peut être conservée à 4 ° C pendant 2 mois.
- Ajouter 1 mL de solution de NCM à l’étape 1.2 sur un appareil filtre centrifuge du MWCO 100 kDa, suivie de 4 mL d’eau stérilisée exempte de nucléase. Centrifuger pendant 10 min à 4 000 x g à RT pour supprimer supplémentaire DSPE-PEG2000-amine. Répétez l’ajout de 4 mL d’eau et la centrifugation 5 x. Plus de 0,5 mL de solution SWCNT reste seront laissé dans le filtre après chaque centrifugation.
- Mesurer la concentration de la solution SWCNT reste dans le filtre à l’aide d’un spectromètre UV/VIS à 808 nm après le lavage final. La concentration finale est généralement environ 50 mg/L (calculé selon la méthode développée par Kam et al.18).
Remarque : Assurez-vous que la simple couche DSPE-PEG-fonctionnalisés est solubles dans l’eau après l’étape 1.4 et est stables dans les différentes solutions biologiques sans agrégation visible après quelques semaines.
2. conjugaison de l’Anti-MALAT1 Gapmer ADN flanqué de 2'-O mis à jour le RNAs à SWCNT fonctionnalisé
- Ajouter 0,5 mg de Sulfo-LC-DPS dans 450 µL du DSPE-PEG2000-amine fonctionnalisés NCM. Ajouter 50 µL de PBS de x 10 et puis incuber pendant 2 h à température ambiante.
- Pour supprimer des Sulfo-LC-DPS supplémentaire, ajouter la réaction de l’étape 2.1 sur un appareil filtre centrifuge du MWCO 100 kDa, suivie de 4 mL d’eau exempte de nucléase. Centrifuger pendant 10 min à 4 000 x g à RT. Repeat l’ajout de 4 mL d’eau et la centrifugation x 5.
- Ajouter 200 nM thiols modifiés anti-MALAT1-Cy3 gapmer ADN dans 1,5 mL de solution commerciale de DTT et incuber pendant 90 min à RT. purifier le produit avec une colonne de NAP-5, suivant le protocole du fabricant. Éluer les anti-MALAT1-Cy3 avec 500 µL de stérilisé sans nucléase 1 x PBS.
Remarque : Le NCM fonctionnalisé peut être stocké avec TNT supplémentaire, qui pourrait se clivent disulfures formés lors du stockage de la thiolés anti-MALAT1 gapmer ADN. La TNT ajoutée peut être retirée par l’aNAP-5 colonne avant la conjugaison avec le NCM. - Recueillir la solution DSPE-PEG2000-amine SWCNT sulfo-LC-DPS-traités a laissé dans le filtre et le diluer avec 500 µL de solution d’anti-MALAT1-Cy3. Ensuite, il incuber à 4 ° C pendant 24 h. Le conjugué SWCNT-anti-MALAT1 peut être stockés à 4 ° C pendant 3 semaines. Suivant la même procédure, le NCM conjugué avec oligo antisens scramble peut être synthétisé et utilisé comme SWCNT-contrôle.
3. queue Injection dans la veine de SWCNT-Anti-MALAT1
-
Générer un modèle de souris disséminée de MM.
- Pour obtenir les meilleurs résultats de la comparaison, au hasard organiser 14 clin de œil. Souris CB17-Prkdcscid/J (8 semaines) en groupes de l’essai ou de contrôle (sept dans chaque groupe) avec le même ratio homme/femme.
- Nettoyer le banc de l’opération et stériliser à l’alcool à 70 %.
- Utilisez une lampe chauffante pour réchauffer la souris pour aider la queue veineuse pour apparaître. Immobiliser la souris correctement avec une drisse d’injection de queue.
- Injecter des cellules de 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry dans 50 µL de PBS dans la veine de la queue sans anesthésie. Appuyez sur le site d’injection avec un tampon imbibé d’alcool pour 30 s. marque la souris injectée et remettez-le dans une cage propre.
-
Commencer le traitement sur le 7e jour après l’injection de cellules MM.1S.
- Injecter 50 µL de PBS contenant SWCNT-anti-MALAT1 dans la veine de la queue de la souris. Utilisation PBS contenant SWCNT-contrôle comme un contrôle.
- Appuyez sur le site d’injection avec un tampon imbibé d’alcool pour 30 s.
- Observez le saignement local sur la queue et le comportement général de la souris pendant 1 min et puis la remettre à une cage propre. Observez tout injecté de souris à nouveau avant de retourner la cage sur le rack, pour s’assurer que les injections sont bien tolérées.
-
Renouveler l’injection tous les 7 jours jusqu'à la fin de l’expérience.
- Mettre fin à l’expérience lorsque la souris les soins de santé se dégrade : quand ne pas manger ou boire, l’apparition des pattes pâles, tout saignement sous-cutanés, un essoufflement, diminution de l’activité, une paralysie des membres inférieurs, et/ou une masse palpable dans le abdomen est observée.
4. evaluation de la Progression de la maladie
- Évaluer l’état général des souris tous les jours après l’injection de cellules MM.1S-Luc-mCherry. Accorder une attention particulière si les souris se paralyse des membres inférieurs.
-
Évaluer la croissance de la tumeur à l’aide d’un appareil d’imagerie in vivo 1 x par semaine, avant l’injection SWCNT-anti-MALAT1.
- Préparer les frais 15 mg/mL D-luciférine avec du PBS 1 x.
- Anesthésier les souris avec un vaporisateur isoflurane (3 à 5 % pour l’induction et 1 à 3 % pour l’entretien, selon l’état des souris).
- Injecter par voie intrapéritonéale de 150 mg/kg D-luciférine dans chaque souris, 5 min avant l’imagerie ; Ensuite, l’image les souris dans une position couchée avec un spectre de système d’imagerie.
- Recueillir des images séquentielles des souris toutes les 2 min, jusqu'à ce que la saturation de la luminescence est atteint. Régler l’intervalle de temps selon l’absorption D-luciférine/signal.
- CO2 permet de sacrifier les souris après avoir atteint la fin de l’expérience.
-
Puisqu’il s’agit d’un modèle de diffusion de MM, traiter les souris comme suit.
- Peser la souris avant la dissection.
- Recueillir le sang périphérique du fond du cœur pour un dosage de la numération formule sanguine (CBC) interprété par une machine de compteur de cellules sanguines. Les comtes de globules rouges et les globules blancs, ainsi que le taux de lymphocytes, est les principaux index.
- Isoler la rate et pesez-le. Calculer le ratio de rate/poids ; envisager de > 0,5 % comme l’élargissement de la rate.
- Recueillir les tissus de la moelle osseuse, ganglions lymphatiques, rate, rein et les tissus présentant des métastases visible.
- Recueillir la colonne vertébrale si la souris a développé une paralysie des membres inférieurs.
- Extraire l’ARN et des protéines des échantillons de moelle osseuse.
- Fixer tous les tissus restants dans du formol.
- D’un détartrage, immergez les échantillons osseux dans la solution d’EDTA 0.25 M (pH 8,0) pendant 5 jours après 24h de fixation.
- Plongez tous les échantillons dans 75 % d’alcool pour le stockage à long terme.
- Comparer l’intensité du signal de la luciférase dans les points dans le temps même dans les deux groupes. Des deux groupes, enregistre les dates de sacrifice de chaque souris et on calcule les courbes de survie des deux groupes avec le logiciel.
Remarque : Toutes les procédures sont résumées dans la Figure 1.
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Representative Results
Pour démontrer l’effet d’inhibition de l’anti-MALAT1 gapmer ADN en MM, nous renversé l’expression de MALAT1 et utilisé dans les cellules H929 et MM.1S. Quarante-huit heures plus tard, les cellules ont été prélevés pour l’analyse de l’efficacité de la précipitation et le statut de l’apoptose dans les cellules transfectées avec gapmer anti-MALAT1 ou contrôle ADN. résultats qRT-PCR ont montré que les anti-MALAT1 gapmer ADN renversé efficacement l’expression de MALAT1 dans les cellules H929 et MM.1S (Figure 2A). Le statut de l’apoptose a été déterminé par cytométrie en flux, qui a révélé MALAT1 diminuées induit l’apoptose significativement (Figure 2B).
Ces résultats indiquent que les anti-MALAT1 oligos inhibent MM efficace in vitro. Toutefois, une livraison efficace méthode/navette pour anti-MALAT1 oligos in vivo devaient être développés, qui est aussi l’obstacle des oligonucléotides antisens en application clinique ; D'où notre intérêt pour NCM. SWCNT est un nanomatériau roman pour la délivrance de médicaments, qui peut se développer hydrophilicité et dissolubilité après les modifications appropriées ; par conséquent, il peut fournir des cargaisons sous différentes formes, tels que les médicaments de l’oligonucléotide. Pour valider l’efficacité de la livraison du NCM in vivo, nous avons tout d’abord fonctionnalisés le NCM avec DSPE-PEG2000-amines, doté d’une spécificité hydrophilicité et liaison au NCM19. Ensuite, cette SWCNT fonctionnelle a été traitée avec sulfo-LC-DPS pour créer les groupes sulfhydryles gratuit, qui seront utilisés pour se connecter avec les oligo. Pour conjuguer les oligo anti-MALAT1 et le NCM sulfo-LC-DPS-traités, les extrémités 5' de l’oligo anti-MALAT1 a été modifiée avec des groupements thiol (S-S) ; pour visiblement suivre la livraison, les extrémités 3' de l’oligo anti-MALAT1 a été modifiée avec la cyanine 3 (Cy3). Après toutes les étapes de la synthèse, NCM-anti-MALAT1-Cy3 a été obtenue (Figure 1)12. Ensuite, il a été ajouté au milieu de culture de cellules H929-GFP et MM.1S-GFP pour valider l’efficacité de la livraison.
Comme illustré à la Figure 2C, NCM-anti-MALAT1-Cy3 a été efficacement livré dans le noyau des cellules MM et réprimé significativement le niveau de MALAT1 endogène dans les cellules des H929 et MM.1S (Figure 2D). Afin d’examiner la toxicité et la sécurité du NCM dans les cellules normales, NCM-anti-MALAT1-Cy3 a été ajouté dans le milieu des cellules BMEC-1 à différentes concentrations ; Lipofectamine était le contrôle du traitement ; milieu ordinaire a été utilisée comme contrôle essentiel (Figure 2E). Ensuite, la viabilité cellulaire a été détectée à l’aide d’un kit de test de viabilité cellulaire sur le jour 1 et jour 2 jour 3. Aucune différence significative dans l’inhibition de la viabilité cellulaire a été trouvé entre SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 et le contrôle de traitement à différents dosages et points dans le temps. Il n’y avait aucune différence par rapport au milieu de la plaine (NC), qui indique que la toxicité du NCM-anti-MALAT1-Cy3 est semblable au contrôle de traitement, qui présente une toxicité limitée et acceptable pour les cellules normales à haute dose.
Ensuite, un modèle de souris disséminée homme-MM a été créé pour évaluer les effets du traitement de SWCNT-anti-MALAT1 in vivo. Tout d’abord, chaque souris SCID-beige (de 8 semaines) a été injecté avec 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry cellules par voie intraveineuse (Figure 3). Un total de 14 souris ont été injectées avec des cellules MM.1S ; parmi eux, sept souris étaient disposées au hasard dans un groupe de traitement SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 et sept autres était dans le groupe témoin. Tant SWCNT-anti-MALAT1 et oligos SWCNT-contrôle ont été dissous dans 0,5 mL de solution 1 PBS x et injecté dans les veines de queue 7 jours après l’injection de cellules tumorales. Le traitement SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 se répétait tous les 7 jours jusqu'à la fin de l’expérience. Afin d’évaluer le fardeau de la tumeur, le signal de la luciférine a été observé par un système d’imagerie in vivo (IVIS) 30 min après l’injection de la luciférine 1 x par semaine avant l’injection SWCNT-oligo. Nous avons constaté que les signaux de la luciférine des souris dans le groupe de traitement SWCNT-anti-MALAT1 ont été remarquablement bas comparés avec ceux du groupe traitement SWCNT-contrôle après 21 jours de traitement (à partir de 28 jours). Leur état de santé et la survie a été vérifié et enregistré chaque jour et résumées dans une courbe de Kaplan-Meier. D’après ces résultats, nous avons conclu que le NCM-anti-MALAT1 traitement par injection intraveineuse peut fournir efficacement les oligos anti-MALAT1 de cellules tumorales. Nous, puis, limité la charge tumorale et prolongé la durée de vie de la souris (p = 0,04) comme prévu, qui est semblable aux résultats obtenus in vitro. Nous n’avons trouvé aucun effets secondaires importants du traitement chez les souris pendant la période de toute expérience, qui a indiqué que l’injection SWCNT-anti-MALAT1 est un traitement sûr pour les souris ; SWCNT est donc un système de livraison in vivo sûr et fiable pour les anti-MALAT1.
Figure 1 : Schéma de principe de la synthèse, absorption, et in vivo dissociation d’un oligo de gapmer SWCNT-anti-MALAT1-Cy3. NCM (A) a été fonctionnalisé avec DSPE-PEG2000-amines et, par la suite, conjugué avec l’anti-MALAT1-Cy3 par liaison disulfure médiée par Sulfo-LC-DPS. (B) SWCNT conjugué anti-MALAT1 a été injecté dans une souris avec des cellules de MM.1S-Luc-mCherry via la veine caudale. (C) SWCNT conjugué anti-MALAT1 pénètre la membrane bicouche phospholipidique par insertion ou endocytose. (D) NCM-anti-MALAT1 a été emballé dans des endosomes précoces après absorption par les cellules ; Ensuite, l’endosome précoce est arrivée à échéance d’un endosome tardif et fusionne avec un lysosome pour former un endolysosome. L’endolysosome aide à libérer les anti-MALAT1 de la SWCNT en brisant le pont disulfure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : SWCNT-anti-MALAT1 a été livré avec efficacité avec une toxicité minimale et induit l’apoptose dans les lignées cellulaires MM. SWCNT-anti-MALAT1 gapmer oligo ou oligo SWCNT-témoins ont été transfectées par Lipofectamine en cellules H929 et MM.1S, respectivement. Quarante-huit heures plus tard, nous avons recueilli les cellules pour (A), l’analyse de l’expression MALAT1 par qRT-PCR et l’analyse de l’apoptose (B) par cytométrie en flux. (C) H929-GFP et MM.1S-GFP de cellules ont été conjointement cultivés avec SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 pendant 48 heures ; l’efficacité de la livraison a été déterminée par microscopie à fluorescence (les barres d’échelle = 100 µm). (D), l’ofMALAT1 niveau de l’expression a été détectée par qRT-PCR, qui a montré qu’il a été renversé avec succès dans les cellules H929 et MM.1S (** p < 0,01, *** p < 0,001). NCM (E) et le contrôle de traitement ont été ajoutés dans un milieu de culture des cellules BMEC-1 à différents dosages. La prolifération a été mesurée à l’aide d’un kit de test de viabilité cellulaire. Ce chiffre a été modifié par Hu et al.,16. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Myélome qui poussent dans le modèle de souris disséminée de MM MM.1S-cellule-construit a supprimé SWCNT-anti-MALAT1. Les cellules de 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry (A) ont été injectés par voie intraveineuse à des veines de queue de souris SCID-beige irradiées (sept dans chaque groupe) ; 50 μL d’un SWCNT-anti-MALAT1 ou solution SWCNT-témoin ont été injectés tous les 7 jours via la veine caudale dès le 7e jour après l’injection de cellules MM.1S. IVIS a été utilisé pour surveiller la croissance de la tumeur. (B) membre postérieur paralysie et tumeur fardeau ont été utilisés comme points de terminaison, et les données de survie ont été analysées par une analyse de Kaplan-Meier. Ce chiffre a été modifié par Hu et al.,16. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Preuve a démontré que les lncRNAs participent à la régulation de nombreuses procédures physiologiques et physiopathologiques dans les cancers, y compris MM7,8,9; Ils ont le potentiel d’être la cible pour le traitement du cancer, qui peut être réalisé par oligonucléotides antisens20,21,22. La U.S. Food and la Drug Administration (FDA) a approuvé plusieurs médicaments d’oligonucléotides antisens, y compris fomivirsen cytomégalovirus rétinite23, mipomersen pour hypercholestérolémie familiale homozygote24, nusinersen pour atrophie musculaire spinale25et eteplirsen pour la dystrophie musculaire de Duchenne26. Dans cette étude, nous avons modifié la gapmer anti-MALAT1 ADN avec 2'-OMe-RNA et il conjugué avec SWCNT fonctionnelle. Le NCM transporte et livre oligos anti-MALAT1 comme un service de navette, qui a non seulement amélioré l’affinité de l’oligo-cible en raison de sa souplesse et de chargement multiple mais aussi stabilisé les oligos et a contribué à prévenir la dégradation de la nucléase lors de l’accouchement27 .
Une modification appropriée sur la surface du simple couche peut aider il obtenir dispersibilité fiable dans les environnements physiologiquement pertinents, aqueuses et promouvoir leur biodistribution28,29. Nous avons utilisé DSPE-PEG2000-amine pour modifier le NCM, qui a été prouvé à greffer sur SWCNT et améliorer la solubilité dans l’eau de celui-ci, et en outre, il a montré excellente stabilité sans agglomération dans la masse filtrante biologique30. Sulfo-LC-DPS a été utilisé comme une reticulation dans l’expérimentation, qui a aidé SWCNT fonctionnalisé pour lier le gapmer anti-MALAT1 ADN par liaison disulfure et de les livrer par la suite dans les cellules. Une fois le NCM pénétré dans les cellules MM, elles ont été reprises par les endosomes précoces (pH ~ 6.0), qui a ensuite abouti au fin endosomes (pH ~ 5.0) accompagnée d’une valeur de pH réduit31. L’avantage de la liaison de PEG, c’est que la liaison est stable à pH > 6, mais jusqu'à 75 – 95 % de la drogue PEG-lié est sorti dans les 2 heures une fois que le pH devenue inférieur à 5,532,33,34. Endosomes transportant SWCNT-anti-MALAT1 a fusionné avec les lysosomes (pH 4,5 ~) pour former un endolysosome, puis le disulfure d’obligations ont été catalysées par la réductase de thiol lysosomal, qui a été activée optimale à un pH bas35. Ceci, libéré par la suite, libre anti-MALAT1 gapmer ADN. Selon les résultats d’expérience in vitro et in vivo, le NCM exécutées efficacement les SWCNT-anti-MALAT1 et lui a permis d’agir de la même façon en fonction d’anti-MALAT1 in vitro.
Le passage de simple couche fonctionnalisé par double couche phospholipidique via deux modèles :36,d’insertion37 et l’endocytose de38,39. Ces procédures aident le NCM livrer des cargaisons dans des cellules sans interrompre la stabilisation des membranes cellulaires, donc réduit la toxicité de la NCM. Nous avons injecté 50 µL de SWCNT-anti-MALAT1 (~ 40 mg/L) dans chaque souris (~ 20 g) ; ainsi, la concentration du médicament final 0,1 mg/kg, ce qui est beaucoup plus faible que la dose que nous avons utilisés dans des expériences de toxicité (2 mg/L et 4 mg/L). Sous le nom précédent est ressorti, NCM a le même effet que le contrôle de traitement (p. ex., Lipofectamine) sur la croissance cellulaire et de viabilité à appariés dosages. Le contrôle de traitement est un réactif commun pour la transfection de cellules et est censé avoir une toxicité limitée et acceptable aux cellules ; ainsi, nous croyons que SWCNT seulement a une toxicité minimale pour les cellules normales.
Comme un service de navette pour les oligonucléotides antisens, le métabolisme est une autre considération importante pour la sécurité du NCM. Il a été démontré que SWCNT fonctionnalisé est principalement excrété par les reins, sans toxicité glomérulaires et tubulaires40. Nous n’avons pas trouvé rein des symptômes liés au dysfonctionnement, tels que l’oligurie, anurie, œdème, changements de l’aspect du rein, etc., chez les souris qui ont accepté l’injection NCM. Ainsi, simple couche n’ont aucun effet de toxicité due à l’accumulation anormale dans une souris avec une fonction rénale normale.
Nous sommes les premiers à conjuguer des oligonucléotides anti-sens ciblage lncRNA avec SWCNT fonctionnalisé et utilisez-le pour traitement MM. SWCNT est un type de nouveaux nanomatériaux, qui a la chiralité cohérente, diamètre facultatif et la distribution de longueur. Après le traitement fonctionnalisation, simple couche développer solubilité dans l’eau et biocompatibilité et de devenue une navette biologique idéale pour livrer la cargaison nombreux à travers la membrane cellulaire, ce qui augmente la distribution des médicaments et l’amélioration de l’effet du traitement. En outre, SWCNT peut stabiliser les molécules oligonucléotides anti-sens de nucléase digestion1. Comme le montrent les résultats, le fonctionnalisés SWCNT-anti-MALAT1 prononcé MALAT1 en cellules MM efficacement et inhibe la croissance MM dramatiquement dans les lignées cellulaires in vitro et dans un modèle de souris disséminée in vivo. Jusqu'à présent, nous n’avons pas observé aucune toxicité due au traitement SWCNT dans ces expériences. Cette étude démontre que SWCNT est un véhicule de livraison sûr et efficace pour les médicaments d’oligonucléotides antisens et a le potentiel d’être utilisé comme support pour les molécules thérapeutiques chez les patients.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient l’Institut de recherche Lerner de protéomique, génomique et carottes d’imagerie pour leur aide et soutien. Financement : Ce travail a été soutenu financièrement par subvention de NIH/NCI R00 CA172292 (pour J.J.Z.) et fonds d’amorçage (à J.J.Z.) et la clinique et translationnelle Science Collaborative (CNTC) de la Case Western Reserve University Core utilisation pilote Grant (à J.J.Z.). Ce travail a utilisé le microscope confocal Leica SP8 qui a été acheté grâce à un financement des instituts nationaux de santé SIG grant 1S10OD019972-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
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